金花茶在黄曲霉毒素B1诱发大鼠肝癌过程中的作用及其机制

摘要

肝细胞癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，尤其在我国及东南亚和非洲地区更为明显，我国肝癌死亡率位居恶性肿瘤第二位，而广西则是我国肝癌高发地区，肝癌死亡率位居恶性肿瘤的首位，并且呈显著上升态势。肝癌发病急骤，发展迅速，多数患者就诊时已属中、晚期，预后极差。即使肝细胞癌早期采取有效的综合治疗措施，5年生存率也处于50％左右，因此，开展肝癌危险因素及发病机制究、开展三级预防工作尤为重要。
　　至今公认的HBV感染、黄曲霉毒素B1(AFB1)摄入及居民饮用水源污染被认为是导致肝癌的三大危险因素。AFB1在肝癌高发地区污染相当严重，尽管开展了“防霉去毒”等防癌宣传教育工作，由于种种原因，居民粮食中难免受AFB1不同程度污染，人类在日常生活中很难避免暴露于AFB1之中。因此，探讨具有抗AFB1致癌作用的天然物具有十分重要意义。AFB1致癌机理不是十分清楚，但有研究报道，AFB1在机体内通过肝脏氧化代谢酶系的作用，才能形成具有致癌活性的中间体或形成复合物，使AFB1降低或失去生物活性。这类酶系的代表主要有CYPs和GSTs，而它们与AFB1致肝癌密切相关的主要有CYP3A4和GST-Pi酶。金花茶含有多种氨基酸、茶多酚等活性物质，具有抗氧化、抗血管生成及调节基因表达的作用，其能否作为化学干预剂阻断AFB1致大鼠肝癌发生以及其抗癌作用的机制，是本文研究的主要内容及目标。目前国内外尚未见同类研究报道。
　　方法
　　选取Wistar大鼠70只，按体重随机将其分为A、B、C3组。A组:AFB1组，25只，按照200μg/kg·BW腹腔注AFB1至52W。B组:金花茶组，25只，每天以灌胃的方法饲以30％金花茶浓缩液，腹腔注AFB1剂量同A组。C组:20只，为空白对照组，不给AFB1和金花茶处理。每周称各组动物体重并按照体重计算注射AFB1的量。每10周进行抽血及肝活检，第73周结束实验，处死各组动物，取血、肝及肿瘤组织。选取不同时期肝组织应用荧光分光光度法检测肝组织CYP3A4酶活性及免疫组化法检测GST-Pi、STAT3蛋白的表达情况。
　　结果
　　1.大鼠肿瘤发生情况:
　　AFB1诱发大鼠肝恶性肿瘤发生的最早时间在第52W，第一例肝癌的发生在第55W，均为AFB1组大鼠。在诱癌不同阶段肝组织的损伤程度有明显差异，且三组间肝脏损伤程度亦不一致。金花茶干预组各阶段大鼠肝脏损害均较AFB1组轻，增生性病变发生比AFB1组亦较晚，大鼠平均生存时间及肝癌发生率亦显著低于AFB1组。对照组无上述改变。
　　第73W实验结束时，恶性肿瘤发生率AFB1组和金花茶组分别为76.5％(13/17)和25.0％(4/16)，肝细胞癌发生率AFB1组和金花茶组分别为58.8％(10/17)和18.8％(3/16)，与AFB1组相比，恶性肿瘤发生率和HCC发生率显著高于金花茶组(P=0.0053和P=0.0324)。对照组无肿瘤发生。
　　2.大鼠肝组织CYP3A4酶活性的变化情况
　　在整个实验过程中，动态观察各组肝组织CYP3A4酶活性，结果显示各组CYP3A4酶活性在23W和53W呈现双波峰变化;AFB1组和金花茶组CYP3A4酶活性在23W升高到顶峰，AFB1组在53W和63W，CYP3A4酶活性高于金花茶组和对照组，差别有统计学意义（P＜0.05）。对照组CYP3A4酶活性在整个实验过程中，除33W和63W出现明显降低外，其他各阶段变化不大。
　　3.大鼠肝组织GST-Pi蛋白的表达情况
　　GST-Pi阳性染色定位于细胞质中，阳性细胞呈灶状或片状分布。在诱癌过程中，AFB1组和金花茶组GST-Pi蛋白表达随着诱癌时间的延长而逐渐增强，尤其在AFB1组更明显，在33W、53W、73W时GST-Pi的表达率:AFB1组为73％、86.7％、93.3％，金花茶组为66.7％、80.0％、80.0％，前者均相应高于后者。对照组在73W时表达率为10％，其他时段均为阴性表达。同一时段不同组间比较，在第33W至73W，AFB1组及金花茶组显著高于对照组，差别有统计学意义(P＜0.05)，在第33W至63W，AFB1组高于金花茶组，但无显著性差异，在第73W，AFB1组显著高于金花茶组和对照组，差别有统计学意义(P=0.000)。其余各组之间或同组不同时段之间大鼠GST-Pi蛋白的表达均无显著差异(P＞0.05)。
　　4.大鼠肝组织STAT3蛋白表达情况
　　STAT3阳性染色定位于细胞质中，阳性细胞呈散在或灶性分布。AFB1组和金花茶组，在诱癌过程中STAT3蛋白表达随诱癌时间的延长而逐渐增强，在33W、53W和73W时STAT3的表达率:AFB1组为20.0％、53.3％、86.7％，金花茶组为13.3％、40.0％、60.0％。同一时段不同组间比较，在上述时段AFB1组及金花茶组高于对照组，差别有统计学意义(P＜0.05)，在第53W至73W，AFB1组高于金花茶组，但无显著性差异(P＞0.05）。
　　结论
　　1.金花茶浓缩液具有抑制AFB1诱发大鼠肝癌的发生率，具有抗AFB1致肝癌作用，可作为潜在的人类肝癌化学预防剂。
　　2.在AFB1诱癌过程中，金花茶浓缩液能抑制CYP3A4酶的活力，从而减少前致癌物的代谢，降低其致癌性及其化学性肝损伤达到保护肝脏的作用。
　　3.在AFB1诱癌过程中，金花茶浓缩液能抑制GST-Pi和STAT3蛋白表达，阻止细胞分裂和恶性增殖，延缓肿瘤的发生，可能与启动子CpG岛甲基化和启动STAT3下游基因的活化，并阻断了某些重要抑癌基因的活性有关。

目录

声明

主要英文缩略语

摘要

前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 实验检测方法

1．4 GST-Pi／STAT3蛋白免疫组织化学染色

1．5 统计学处理

2 结果

2．1 各组大鼠实验基本情况

2．2 各组大鼠体重变化情况

2．3 各组大鼠肿瘤发生情况

2．4 组织形态学变化情况

2．5 大鼠肝组织代谢酶CYP3A4活性的变化情况

2．6 大鼠肝组织GST-Pi的表达情况

2．7 大鼠肝组织STAT3蛋白的表达情况

3 讨论

3．1 大鼠肝癌模型的选择

3．2 金花茶对大鼠癌变过程中组织病理学变化的影响

3．3 金花茶对大鼠肝组织CYP3A4活性变化的影响

3．4 金花茶对大鼠肝组织GST-Pi表达的影响

3．5 金花茶对大鼠肝组织STAT3表达的影响

小结

创新点

参考文献

获奖励情况

综述 细胞色素P450酶系CYP3A在化学物质诱导癌变中的作用及研究现状

致谢