特异性肿瘤细胞核靶向药物载体系统抗肝癌研究

摘要

核靶向药物释放载体能够实现在肿瘤细胞核内定点释放具有DNA毒性的化学药物，对提高实体肿瘤的治疗效果具有重要意义。但是，核靶向药物载体不能靶向肿瘤细胞膜，这极大限制了其在体内抗肿瘤方面的应用。因此，开发一种能通过静脉给药并且能通过血液循环依次靶向到细胞膜与细胞核的多种功能的纳米药物载体是非常有意义的。本研究第一次将肝癌特异性核酸适配体TLS11a修饰到磷脂双分子层表面，合成了一种用于核靶向药物载体(DOX/TATp-MSN)从血液循环到肿瘤细胞膜运输的系统(TLS11a-LB)。该系统能将核靶向药物载体DOX/TATp-MSN/特异性运输到肿瘤细胞胞浆。然后，利用TATp的细胞核转运能力将50nm左右的DOX/MSN纳米药物载体转运到细胞核内，以实现在体内肿瘤细胞核内阿霉素定点靶向释放，从而有效提高阿霉素在体内抗肿瘤的效果。这为核靶向药物载体的体内靶向治疗提供了一种新的有潜在应用前景的策略。本研究的内容和结果如下:
　　如何实现在肿瘤细胞核内定点释放具有DNA毒性的化学药物，从而提高实体肿瘤的治疗效果依然是有待解决的难题。
　　目的:研发一种能通过静脉给药并且能通过血液循环依次特异性靶向到细胞膜与细胞核的多种功能的纳米药物载体，实现在肿瘤细胞核内定点释放具有DNA毒性的化学药物，从而提高实体肿瘤的治疗效果。
　　方法:将肝癌特异性核酸适配体TLS11a修饰到磷脂双分子层表面，合成一种用于核靶向药物载体（DOX/TATp-MSN）从血液循环到肿瘤细胞膜运输的系统(TLS11a-LB)。将核定位信号(nuclear localization signal，NLS)TAT p与氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子反应生成核靶向药物载体TATp-MS N。用TATp-MSN负载抗肿瘤药物阿霉素(DOX)制备成DOX/TATp-MSN纳米粒子。利用自组装技术将TLS11a-LB包裹到DOX/TATp-MSN表面，形成DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN，制备成能够实现肿瘤细胞膜和细胞核靶向的多功能纳米粒子DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN。该系统能将DOX/TATp-MSN特异性运输到肿瘤细胞浆内。然后，利用TATp的细胞核转运能力将50nm左右的DOX/MSN纳米药物载体转运到细胞核内，以实现在体内肿瘤细胞核内阿霉素定点靶向释放。使用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering Instrument，DLS)测定制备材料的粒径大小以及电位变化。BJH方法检测介孔二氧化硅比表面积、孔容积和孔大小分布。使用傅里叶红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR)证明核定位信号肽TATp是否成功修饰到介孔二氧化硅表面。利用透射电镜观察合成的纳米材料的大小，外貌。体外模拟肿瘤微环境考察药物释放效果。通过荧光显微镜观察DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN细胞内阿霉素释放效果。通过流式细胞仪技术评估各实验组药物摄入量。通过细胞吞噬实验验证DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN纳米材料的核靶向性。CCK-8检测纳米载药材料对肿瘤细胞的毒性。建立BALB/c小鼠肝癌模型，注射DiR标记的TLS11a-LB@TATp-MSN纳米粒子，通过活体成像观察纳米材料在体内的分布情况、代谢情况及肿瘤靶向性。通过观察肿瘤大小、体积、重量以及生存曲线以考察双靶向材料体内抗肿瘤效果。
　　结果:透射电镜图像显示TLS11a-LB@TATp-MSN纳米材料大小在100nm以内，可以清楚显示表面的磷脂双分子层(TLS11a-LB)。细胞吞噬实验显示DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN纳米材料能够高效靶向到肿瘤细胞核内部。体外药物释放实验显示DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN在模拟pH7.4的体液环境时稳定性强且药物泄露少。TLS11a-LB@TATp-MSN纳米材料对药物包封率达到83.3％。流式细胞仪技术及荧光显微镜技术结果显示DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN能明显提高肿瘤细胞药物摄入量。小动物活体成像结果显示TLS11a-LB@TATp-MSN能在体内靶向到肿瘤组织。H22肿瘤组织冰冻切片结果显示DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN能更加高效地分布到肿瘤局部并能明显提高肿瘤局部的药物量。体内治疗显示DOX/TLS11a-LB@TATp-MSN双靶向纳米材料能够显著提高体内抗肿瘤效果，明显抑制肿瘤生长速度，延长荷瘤小鼠生存期。
　　结论:TLS11a-LB肝癌特异性靶向系统能够实现核靶向药物载体DOX/TATp-MSN在体内的运输，克服了DOX/TATp-MSN对细胞的非特异性，为核靶向药物载体的体内靶向治疗提供了一种新的有潜在应用前景的策略。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1．材料

1．1 细胞系及培养条件

1．2 实验动物

1．3 主要化学试剂

1．4 核定位信号肽TATp及TLS11a适配体

1．5 其他相关试剂

1．6 主要仪器设备

1．7 实验相关试剂配制

2．方法

2．1 合成核靶向纳米药物释放载体TATp-MSN

2．2 合成肝癌特异性靶向系统(TLS11a-LB)

2．3 合成特异性肝癌细胞核靶向药物(DOX／TLS11a-LB@TATp-MSN)

2．4．表征

2．5 细胞培养

2．6 体外阿霉素释放研究

2．7 体外细胞阿霉素摄入考察

2．8 荧光显微镜观察纳米粒子细胞内定位

2．9 CCK-8法评估体外细胞毒性

2．10 活体成像验证材料体内对肿瘤靶向性

2．11 体内抗肿瘤效果研究

3．结果

3．1 DOX／TLS11a-LB@TATp-MSN纳米粒子体内核靶向药物释放模拟图

3．2 纳米材料表征检测

3．3 体外验证TLS11a-LB@TATp-MsN纳米材料核靶向性

3．4 阿霉素包封率测定

3．6 肿瘤细胞药物摄入量考察

3．7 DOX／TLS11a-LB@TATp-MSN体外抗肿瘤研究

3．8 TLS11a-LB@TATp-MSN纳米材料体内靶向性考察

3．9 TLS11a-LB@TATp-MSN纳米材料体内靶向及药物分布研究

3．10 TLS11a-LB@TATp-MsN／Dox体内抗肿瘤研究

讨论

小结及展望

参考文献

附录

综述

致谢

攻读学位期间学术成果