IL-17及相关细胞因子在ANIT致胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型中的表达及意义

摘要

目的：研究IL-17A（interleukin-17,以下简称IL-17）及相关细胞因子在α-萘异硫氰酸酯（α-naphthalene isothiocyanate,ANIT）致胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型肝脏、回肠组织中的表达及相互关系，探讨其是否参与胆汁淤积性肝炎、肝纤维化的形成及肠黏膜屏障损伤。
　　方法：24只雄性远交群（sprague dawley,SD）大鼠，体重180±30g,随机分为三组：空白对照组、蓖麻油对照组及ANIT实验组，每组大鼠各8只。空白组不予任何处理；蓖麻油组予蓖麻油灌胃，5ml/kg体重，每周1次，共5次；ANIT组予2％的ANIT(蓖麻油配置)灌胃，100mg/kg体重或5m l/kg体重，每周1次，共5次。第5次灌胃48小时后处死各组大鼠。大鼠予20%乌拉坦麻醉后开腹，腹主动脉取血，检测大鼠外周血中总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰氨转肽酶（γ-GT）、总胆汁酸（TBA）浓度；酶联免疫吸附试验(ELISA)测外周血IL-17、I L-4及γ干扰素（interferon-gamma,IFN-γ）含量；苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠肝组织、回肠组织病理变化；Masson染色观察肝组织纤维化改变；免疫组织化学染色测肝组织IL-17、IL-4及IFN-γ蛋白表达；实时荧光定量PCR法(reverse transcription-polymerase chain reaction,R T-PCR)测大鼠肝组织、回肠组织IL-17、IL-4及IFN-γmRNA的表达水平。
　　结果：⑴肝组织、回肠组织HE染色病理形态学示：空白组及蓖麻油组，肝小叶及汇管区结构正常，肝细胞无变性、坏死，汇管区无炎症细胞浸润，毛细胆管无胆汁淤积，无胆管及纤维组织增生；ANIT组汇管区扩大伴大量炎性细胞（淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞）浸润，胆管增生，管腔内可见坏死脱落细胞，胆管腔阻塞，胆管周围纤维组织增生；空白组、蓖麻油组及ANIT组回肠黏膜绒毛完整,上皮细胞排列整齐，无变性、坏死；肝组织Masson染色镜下观察可见ANIT组胆管周围胶原纤维沉积。⑵肝组织免疫组织化学染色分析结果示：IL-17、IL-4及IFN-γ在ANI T组中的表达结果均为阳性；在空白组、蓖麻油组中的表达结果均为阴性。⑶对腹主动脉血行肝功能检测，ANIT组ALT（437.42±156.37）u/L浓度明显高于空白组（38.63±12.65）u/L及蓖麻油组（60.67±11.48）u/L；A NIT组AST（492.42±179.89）u/L浓度明显高于空白组（132.38±30.25）u/L及蓖麻油组（132.67±35.90）u/L；ANIT组γ-GT（13.33±5.12） u/L浓度明显高于空白组（2.25±0.46）u/L及蓖麻油组（2.5±0.84）u/L；ANIT组ALP（862.79±279.12）umol/L浓度明显高于空白组（256.25±89.83）umol/L及蓖麻油组（209.17±49.37）umol/L；ANIT组TBil（147.53±23.35）umol/L浓度明显高于空白组（0.52±0.12）umol/L及蓖麻油组（0.6±0.14）umol/L；ANIT组DBil（117.21±20.55）umol/L浓度明显高于空白组（0.38±0.13）umol/L及蓖麻油组（0.47±0.12）umol/L；ANIT组TBA（226.19±26.82）umol/L浓度明显高于空白组（16.38±5.04）umol/L及蓖麻油组（14.53±4.41）umol/L，差异均有统计学意义（p<0.01）。⑷ANIT组外周血IL-17含量（216.69±15.53）pg/ml高于空白组（112.25±15.82）pg/ml及蓖麻油组（111.53±8.28）pg/ml，差异有统计学意义（P<0.01）；ANIT组外周血IL-4含量（27.14±1.59）pg/ml稍高于空白组（26.68±0.26）pg/ml及蓖麻油组（26.74±0.25）pg/ml，ANIT组外周血IFN-γ含量（25.53±8.45）pg/ml稍高于空白组（24.29±8.06）pg/ml及蓖麻油组（20.58±8.01）pg/ml，差异均无统计学意义（P>0.05）。⑸ANIT组IL-17mRNA表达量（3.39±1.31）高于空白组（1.31±0.15）及蓖麻油组(1.30±0.25)，差异有统计学意义（P<0.05）；ANIT组肝组织IFN-γmRNA表达量(31.60±14.87)高于空白组(7.35±1.07)及蓖麻油组(6.87±0.62)，差异有统计学意义（P<0.01）；ANIT组IL-4mRNA表达量(4.19±1.31)比空白组（3.80±1.07）及蓖麻油组（3.52±0.77）稍高,差异无统计学意义（P>0.05）。ANIT组回肠组织IL-17mRNA表达量（2.28±0.92）高于空白组（0.62±0.23）及蓖麻油组（0.57±0.09），IL-4mRNA的表达量（0.64±0.28）高于空白组（0.25±0.10）及蓖麻油组（0.20±0.03），差异均有统计学意义（P<0.01）；IFN-γmRNA的表达量（6.18±2.84）高于空白组（2.33±0.73）及蓖麻油组（2.39±0.51），差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：①IL-17及IFN-γ可能通过发挥促炎、促纤维化作用参与大鼠胆汁淤积性肝炎、肝纤维化的形成；IL-4可能与大鼠胆汁淤积性肝炎、肝纤维化的形成无明显相关性。②IL-17、IL-4及IFN-γ可能与大鼠胆汁淤积性肝炎肠黏膜屏障损伤有关。

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前言

1 IL-17等细胞因子生物学特性

2 IL-17、IFN-γ及IL-4与肝脏炎症、肠道的关联

3 Th1、Th2及Th17细胞在疾病中的表达

材料与方法

1 材料

2实验方法

结果

1 动物模型的建立情况

2 肝组织、回肠组织HE染色，肝组织Masson染色结果

3 免疫组化SP法测大鼠肝组织IFN-γ、IL-4、IL-17表达

4 RT-PCR测肝组织/回肠组织IFN-γ、IL-4、IL-17mRNA的表达

5 ELISA测各组大鼠外周血IFN-γ、IL-4、IL-17的水平

6 肝功能指标

讨论

1 胆汁淤积与肝纤维化的关系

2 胆汁淤积与肠黏膜屏障损伤的关系

3 总结

结论

参考文献

综述: 胆汁淤积致肝纤维化相关机制研究

致谢

攻读学位期间发表的学术论文