Th-17/IL-17相关细胞因子在大鼠重症肺炎克雷伯菌肺炎中的表达及意义

摘要

背景：重症肺炎是引起机体多器官功能障碍的肺部感染性疾病。其根据获得环境不同分为重症社区获得性肺炎(Severe community-acquired pneumonia，SCAP)和重症医院获得性肺炎(Severe hospital-acquired pneumonia，SHAP)。SCAP及 SHAP 均有很高的患病率和病死率。流行病学调查显示 SCAP 患者的病死率可高达50％,而 SHAP的死亡率可达 70％。近年来,由于感染的高危宿主增多,细菌耐药甚至多药耐药的现象日益严重,虽然不断有新的抗菌药物出现,重症肺炎仍然诊治困难、预后较差。目前重症肺炎的主要治疗手段还只是依赖抗菌药物、机械通气、液体支持和血液净化等，在占有大量医疗资源的情况下其病死率仍居高不下。因此，探讨重症肺炎的发病机制,寻找新的治疗靶点和治疗方法，对疾病转归、获得早期有效治疗及改善预后，具有极为重要的意义。目前认为，重症肺炎的产生与病原体感染后失控的炎症反应有关，使局部炎症向全身性炎症演变，而非单纯病原菌和毒素损伤的结果。细胞因子介导的炎症反应在重症肺炎的发生、发展及转归中发挥着重要的作用。新近研究发现，机体存在一种新型的不同于Th1型和Th2型的效应T细胞—辅助性17细胞(T help 17,Th17)。该细胞是由天然T细胞前体Th0分化而来，具有与Th1和Th2细胞不同的独立的分化和发育调节机制，其在促炎症反应和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。该细胞能够特异性产生效应因子白细胞介素（IL）-17，而不产生干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)和IL-4，因此被称为Th-17。由于其具有促炎性作用，也被称为炎症性T细胞（inflammatory T cell）。IL-17A是IL-17家族的一个特殊亚型，由一个N-末端信号肽的155个氨基酸组成并由二硫键连接的同型二聚体糖蛋白。IL-17A由未分化的Th细胞在IL-6、转化生长因子-β1、IL-23的共同作用下激活Th17的信号转导和转录激活因子-3(STAT-3)、孤儿细胞核受体γt(RORγt)产生。其与细胞膜上的IL-17受体A（Interleukin-17 receptor A,IL-17RA）结合后诱导固有免疫炎症细胞因子表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、急性反应蛋白、粒-巨细胞刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-2等，共同催化多种炎症细胞在气道及肺内浸润，这些细胞相互作用又可以分泌多种炎症细胞因子，从而构成炎症细胞及炎症因子之间的复杂网络，使局部炎症向全身性炎症演变。目前对Th-17/IL-17相关细胞因子如IL-17、IL-17RA、IL-23、TNF-α、IL-1β在重症肺炎中的表达及作用机制研究甚少，本研究拟通过建立大鼠重症肺炎克雷伯菌肺炎模型，观察Th-17/IL-17相关细胞因子即IL-17、IL-17RA、IL-23、TNF-α、IL-1β在重症肺炎中的表达，探讨其在重症肺炎发病过程中的作用。
　　 目的：通过建立大鼠重症肺炎克雷伯菌肺炎模型，探讨Th-17/IL-17相关细胞因子(IL-17、IL-17RA、IL-23、TNF-α、IL-1β)在大鼠重症肺炎中的表达及意义。
　　 方法：
　　 1.通过气管内滴注肺炎克雷伯菌菌液建立大鼠重症肺炎模型。
　　 2.72只SPF级雄性SD大鼠随机分为重症肺炎模型组（n=36）和对照组（n=36），每组分为6小组（4h组、12h组、1d组、3d组、5d组、7d组），模型组、对照组均为每小组6只。各组分别于设定时间点尾静脉取血行血常规检测，腹主动脉取血行血气分析，收集左肺肺泡灌洗液（BALF）行白细胞及中性粒细胞计数，无菌分离右肺中叶行肺组织匀浆菌落计数，并取右下肺组织甲醛固定行病理组织学观察。
　　 3.模型组及对照组分别于设定时间点收集左肺BALF，离心收集上清液后ELISA检测IL-17、IL-23、TNF-α、IL-1β蛋白浓度，右肺上叶组织提取mRNA行逆转录后荧光定量PCR检测IL-17、IL-17RA、TNF-α、IL-1βmRNA表达水平。
　　 结果：
　　 1.模型组大鼠出现明显的感染中毒症状，呼吸急促，伴明显紫绀，部分出现嗜睡，尿量显著减少，肺组织大体及病理镜下均提示双侧多叶病变，外周血象白细胞及中性粒细胞显著升高，动脉血氧分压进行性下降，于接种细菌后第5天最为严重。
　　 2.模型组IL-17、IL-17RA、IL-23、TNF-a、IL-1βmRNA的表达及蛋白浓度于第4h开始升高，第3d达高峰，TNF-a、IL-1βmRNA的表达及蛋白浓度高峰延迟于IL-17、IL-17RA、IL-23，于第5d升至最高。
　　 3.BALF中性粒细胞计数4h开始升高，于3d达到峰值，此后出现降低趋势。BALF中IL-23与IL-17的蛋白浓度与BALF中性粒细胞计数呈显著正相关，相关系数分别为r=0.72，P<0.01；r=0.79，P<0.01。
　　 结论：
　　 1.气管内滴注肺炎克雷伯菌菌液成功复制大鼠重症肺炎模型。
　　 2.IL-23、IL-17与IL-17RA表达高峰早于TNF-α、IL-1β，提示 IL-23、IL-17和IL-17RA在重症肺炎克雷伯菌肺炎中是更早期的促炎因子。
　　 3.IL-23/IL-17促进呼吸道内中性粒细胞募集和激活，从而促进炎症反应的发生及发展。