基于TGF-β/Smads、ERK信号通路探讨委陵菜酸抑制肝星状细胞的作用及其机制

摘要

目的:
　　肝纤维化是慢性肝损伤后的一种自我修复方式，其特征是细胞外基质(ECM)在肝内的大量沉积。研究表明，TGF-β/Smads和ERK信号通路存在共同的信号传导交汇点Smad4，它们在肿瘤的发生过程中可在多个层次发生串话(Cross-talk)而发挥重要、复杂的重要作用。但这两信号通路在肝纤维化发生过程中是否存在Cross-talk作用仍不清楚。深入揭示这两条通路在肝细胞内信号转导过程中的关系，寻找有效的信号通路调控靶点，对于有效控制肝纤维化的发生发展将具有重要的意义。
　　委陵菜酸(Tormentic acid，TA)是从蔷薇科植物委陵菜（Potentillachinensis Ser.）全草中分离得到一个活性成分。我们前期研究发现，TA对LPS/D-GalN诱导的肝损伤有明显的保护作用，但其对慢性肝病尤其是肝纤维化的作用仍不清楚。
　　因此，本实验首先采用shRNA技术沉默Smad4基因的表达，探讨在肝纤维形成过程中TGF-β/Smads和ERK通路的Cross-talk作用。其次，研究TA对肝星状细胞的抑制作用，并以TGF-β/Smads、ERK信号通路为切入点探讨其作用机制。
　　方法:
　　1.TGF-β/Smads和ERK通路在肝星状细胞中的交互作用
　　先通过对NCBI数据库的检索，获得大鼠Smad4基因mRNA序列，由软件辅助设计出三条Smad4 shRNA序列，同时合成非特异性序列作为阴性对照。本实验构建以慢病毒为载体的Smad4 shRNA，选择感染复数(MOI)值为10、20、30、40、50、60、70、80的病毒分别感染到大鼠肝星状细胞(HSC-T6)，确定最佳的MOI值后，转染细胞，通过qRT-PCR法检测Smad4mRNA的水平，筛选出抑制率最高的RNAi序列作为后续实验。同时，采用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。
　　后续实验设三个组:正常对照组（Control组）、转染空载体的阴性对照组(NC组)、沉默Smad4基因组（shRNA-Smad4组）。CCK-8法检测24、48、72 h细胞的增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期;qRT-PCR法检测Smad4、细胞外信号调节激酶1(ERK1)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)、MAPK激酶2(MEK2)mRNA的水平;免疫细胞化学法检测Ⅰ型胶原(Col-I)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)蛋白的表达;Westem blot法检测Smad4、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达。
　　2.委陵菜酸对HSC-T6细胞的作用
　　采用CCK-8法检测委陵菜酸对HSC-T6细胞的半数抑制率(IC50)，随后将细胞分为6组:正常对照组，PDGF-BB刺激组，抑制剂组(PD98059组)，委陵菜酸高、中、低剂量组（TAH、TAM和TAL组）。利用姬姆萨染色液、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒分别检测TA对细胞集落形成、凋亡及周期的影响;qRT-PCR法检测ERK2、MEK2 mRNA的水平;免疫细胞化学法检测Col-Ⅲ蛋白的表达;Westem blot法检测Smad4、α-SMA、c-Raf、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达。
　　结果:
　　1.TGF-β/Smads和ERK通路在HSCs中的交互作用
　　(1)沉默Smad4基因对细胞增殖及周期的影响
　　实验结果发现，当MOI值为30时，细胞的转染效率达到90％且细胞状态好，故选用其作为感染值。感染成功后，qRT-PCR结果显示，shRNA序列为AGACAGAGCATCAAAGAAA对Smad4基因的抑制效率最高，为75.785％，可用其作为后续沉默Smad4基因的序列。
　　细胞增殖结果显示，与NC组比较，shRNA-Smad4组细胞在24、48及72 h生长缓慢。细胞周期结果显示，与NC组比较，shRNA-Smad4组S期细胞数增多，表明细胞被阻滞于S期。
　　(2)沉默Smad4基因对α-SMA及胶原形成的影响
　　免疫细胞化学结果显示，shRNA-Smad4组与NC组比较，可见阳性表达颗粒明显减少及棕色变浅，表明Col-I、Col-Ⅲ蛋白躲表达明显减少;Western blot结果显示，shRNA-Smad4组α-SMA表达显著下降。
　　(3)沉默Smad4基因对TGF-β/Smads、ERK信号通路的影响
　　qRT-PCR结果显示，与NC组比较，shRNA-Smad4组中，Smad4、ERK1、ERK2、MEK2 mRNA水平均降低;Western blot结果显示，与NC组比较，shRNA-Smad4组Smad4蛋白表达明显降低;shRNA-Smad4组p-ERK1/2与ERK1/2的比值稍下降。
　　2.TA对肝星状细胞的抑制作用
　　(1) TA对HSC-T6细胞IC50
　　实验结果显示，TA能抑制HSC-T6细胞的增殖，且呈浓度依赖性。经SPSS17.0计算出TA对HSC-T6细胞作用24 h的IC50为81.71μM。
　　(2) TA对细胞集落形成的影响
　　实验结果显示，与正常对照组比较，PDGF-BB可促进HSC-T6细胞集落的形成。药物干预后，PD98059及TA高、中、低剂量组均能抑制HSC-T6细胞集落的生成，并且随着药物浓度的增加，抑制效果越明显。
　　(3) TA对HSC-T6细胞凋亡及周期的影响
　　细胞凋亡检测结果显示，与正常对照组比较，经PDGF-BB刺激后，HSC-T6细胞的总凋亡率有所下降，但差异无意义。与刺激组比较，PD98059及TA中、低剂量组总凋亡率未见明显改变。但经TA高剂量组干预后，其总凋亡率明显增加，表明TA可以促进HSC-T6细胞的凋亡(P＜0.05)。细胞周期检测结果显示，与正常对照组比较，PDGF-BB对HSC-T6细胞周期影响无统计学差异，而TA高剂量作用后，明显将细胞阻滞在G2期(P＜0.01)。
　　(4) TA对HSC-T6细胞α-SMA及胶原形成的影响
　　Western blot检测结果显示，与刺激组比较，TA高、中、低剂量均能明显降低α-SMA蛋白的表达(P＜0.05)。细胞免疫化学实验结果显示，与刺激组比较，PD98059组中Col-Ⅲ蛋白的表达明显减少(P＜0.01);在TA高剂量组中可见阳性表达颗粒明显减少及棕色变浅，表明TA高剂量对HSC-T6中Col-Ⅲ蛋白的表达有下调作用(P＜0.05)。
　　(5) TA对HSC-T6细胞TGF-β/Smads、ERK信号通路的影响
　　qRT-PCR结果显示，与刺激组比较，TA高剂量组中ERK2和MEK2mRNA的水平下降(P＜0.05)。Western blot结果显示，TA高剂量组中Smad4、c-Raf的表达降低(P＜0.05)。与刺激组比较，PD98059组中p-ERK1/2与ERK1/2的比值显著降(P＜0.01);经TA作用后，p-ERK1/2与ERK1/2的比值稍下降。
　　结论:
　　1.TGF-β/Smads信号通路的阻断会使ERK信号通路相关基因水平降低，提示TGF-β/Smads信号通路与ERK信号通路之间在肝星状细胞中存在交互作用。
　　2.TA可明显抑制肝星状细胞的增殖和活化、促进其凋亡、降低胶原的生成，其机制可能与阻断TGF-β/Smads、ERK信号通路有关。

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中英文缩略词表

摘要

前言

第一章 探讨TGF-β／Smads、ERK信号通路在肝星状细胞中的Cross-talk作用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二章 委陵菜酸对大鼠肝星状细胞的作用及对TGF-β／Smads、ERK信号通路的影响

1 实验材料

2 实验方法

3．实验结果

4 讨论

全文总结

参考文献

综述 肝纤维化与TGF-β／Smads信号通路关系的研究进展

致谢

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