miRNA调控内皮祖细胞Wnt信号通路参与牵张成骨血管发生机制的初步研究

摘要

目的:牵张成骨具有骨折愈合不可比拟的成骨速率，但至今其成骨机制尚未明了。课题组在前期研究中发现内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)表面标记物CD133在牵张成骨新骨区域具有较高的表达，期间可能存在EPCs参与的血管发生机制;并且，利用高通量测序技术对牵张成骨区域、胚胎骨、骨折断端等组织的miRNAs进行表达量聚类分析，发现miRNA-21,miRNA-10,miRNA-451,miRNA-27b,miRNA-486,miRNA-205在牵张成骨区域及胚胎骨中具有共同表达。因此，我们推测上述miRNAs可能通过调控靶基因进而调控EPCs血管发生，从而促进新骨形成。本实验拟从miRNA的角度初步探索EPCs成血管分化机制。
　　方法:1.EPCs体外分离培养、鉴定及成血管能力检测的研究:抽取3W龄幼犬骨髓约5ml，采用密度梯度离心法分离获取EPCs后:
　　(1)通过倒置像差显微镜下观察EPCs的形态学特点;
　　(2)通过流式细胞仪检测EPCs表面标志物;
　　(3)通过细胞周期流式分析检测EPCs增殖能力;
　　(4)通过Transwell迁移实验及细胞划痕实验检测EPCs迁移能力。
　　2.筛选调控EPCs成血管分化的miRNAs及其生物信息学分析:对EPCs进行成血管诱导1，3，7，10，14，21和28d，设置诱导前细胞株为“0d”组，进行qRT-PCR检测分析miRNA-10，miRNA-451，miRNA-486，miRNA-21，miRNA-205，miRNA-27b的动态相对表达量;同期进行检测分析VEGF-A，bFGF的动态相对表达量，观察miRNAs与VEGF-A，bFGF表达趋势，通过统计学方法分析比较6个miRNAs与VEGF-A，bFGF表达的相关性，挑选出EPCs在成血管过程中可能存在调控作用的miRNA;进一步通过生物信息学对相关的miRNA进行靶基因预测、GO富集和KEGG Pathway分析。
　　3.EPCs在机械力刺激、成血管诱导下Wnt信号通路的差异性表达:取EPCs完全随机分为4组，如下所示:
　　A:静态培养;
　　B:加载离心力24min(100r/min)，每天4次，刺激3d后停止培养;
　　C:加入成血管诱导液诱导3d后终止诱导;
　　D:加入成血管诱导液进行成血管诱导（参照C）并进行机械力刺激（参照B）3d后停止培养。
　　上述4组于特定时间点进行qRT-PCR及WB检测Wnt信号通路相关基因及血管形成标志物VEGF-A的表达。
　　结果:1.EPCs体外分离培养、鉴定及成血管能力检测结果:
　　(1)EPCs的形态学观察:EPCs贴壁生长后，随着培养时间的推移，细胞两端逐渐伸展出纺锤形伪足，细胞之间相互首尾连接，胞体形态亦逐渐发生改变，出现大量的梭形细胞，呈集落式聚集为条索状结构，最终呈圆环样结构，具有明显的管倾向。
　　(2)EPCs中可检测出与ECs不表达的表面标记物CD133。
　　(3)Transwell迁移、细胞划痕实验证明EPCs具有迁移、趋化能力。
　　2.筛选调控EPCs成血管分化的miRNAs及其生物信息学分析:
　　EPCs在成血管分化过程中，microRNA-486，microRNA-205，microRNA-21和microRNA-27b与VEGF-A，bFGF有正相关性，具有显著统计学意义(p＜0.05)。
　　生物信息学对上述miRNAs进行靶基因预测、GO富集和KEGGPathway分析发现:
　　(1)miRNA-27b预测到6191个靶基因，筛选出与成血管有关的靶基因169个;其中三个生物信息学网站交集的靶基因分别为AGGF1，EPAS1，BMPR2。
　　(2)miRNA-21预测到5003个靶基因，筛选出与成血管有关的靶基因98个;其中三个生物信息学网站中有交集的靶基因分别为BMPR2和JAG1。
　　(3)miRNA-205预测到7367个靶基因，筛选出与成血管有关的靶基因169个;其中三个生物信息学网站中有交集的靶基因分别为FOXF1和QKI。
　　(4)miRNA-486预测到6040个靶基因，筛选出与成血管有关的靶基因118个;其中三个生物信息学网站中有交集的靶基因为TIE1。
　　将microRNA-486,microRNA-205,microRNA-21和microRNA-27b进行KEGG信号通路分析后，发现Wnt信号通路、FoxO信号通路为上述microRNAs共有。
　　3.EPCs在机械力刺激、成血管诱导下Wnt信号通路的差异性表达:与对照组相比，qRT-PCR检测LRP5，AXIN，β-catenin，LEF1及成血管标志物VEGF-A在受到机械力刺激、成血管诱导、同时接受机械力刺激及成血管诱导时表达逐步增高，GSK-3β的表达具有相反趋势。Western Blot检测β-catenin及VEGF-A的蛋白表达亦增高。
　　结论:1.EPCs体外培养具备增殖分化形成新生血管的能力，牵张成骨中可能存在EPCs参与的血管发生机制。
　　2.miRNA-486，miRNA-21，miRNA-27b，miRNA-205在牵张成骨血管形成中可能扮演着重要相辅相成的角色，在调控EPCs血管发生的过程中起到了重要的作用。
　　3.miRNA-486，miRNA-21，miRNA-27b，miRNA-205可能通过抑制靶基因，进一步调控Wnt信号通路，达到促进血管生成目的。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一章 内皮祖细胞体外分离培养、鉴定及成血管能力检测的研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二章 筛选调控内皮祖细胞成血管分化的miRNAs及其生物信息学分析

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第三章 内皮祖细胞在机械力刺激、成血管诱导下Wnt信号通路的差异性表达

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

英文缩略语对照

文献综述 miRNA在血管新生中的作用研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文