靶向CD105嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤作用及机制研究

摘要

恶性肿瘤严重危害人类的健康，目前肿瘤主要的传统治疗方法有手术、放疗和化疗。近年来免疫治疗已逐渐成为肿瘤治疗领域的焦点，其中免疫细胞过继治疗成为研究的热点，基于嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR T)的免疫疗法已经证明是一种有希望的癌症治疗策略，嵌合抗原受体T细胞通过基因工程技术使识别肿瘤特异性抗原的受体表达在T细胞表面，绕过抗原提呈阶段以及MHC的限制对肿瘤产生杀伤作用。2017年FDA已批准两个CAR T分别用于急性淋巴细胞白血病和特定类型非霍奇金淋巴瘤。CART对于实体瘤的应用仍受到一定的限制，CAR T治疗过程中存在脱靶效应、胞外段单链抗体结合抗原能力弱及产生免疫原性、利用慢病毒等方法制备CAR T细胞引起的插入突变等问题。因此，选择更特异性的靶标、结合能力更强的抗体，制备安全有效的CAR T细胞是当前急需解决的问题。 Endoglin(CD105)是相对分子量为180kDa的同型二聚体细胞膜糖蛋白，被认为是新生血管内皮细胞的特异标志分子之一，表达于实体肿瘤新生血管及相关肿瘤细胞表面，因此以CD105为靶点构建CAR T细胞为肿瘤免疫治疗提供一个选择。纳米抗体仅由Camilidae的重链抗体的VHH结构域组成，不具有轻链，这些单一的抗原结合结构域容易表达并保留对特定抗原的亲和力。前期研究成功筛选出CD105纳米抗体，该纳米抗体能与肿瘤细胞表面抗原CD105分子特异性性结合，能否通过构建该纳米抗体的CAR T细胞增强抗肿瘤作用仍需进一步研究。 目的：探索构建CD105纳米抗体CAR T细胞的方法，探索CD105CAR T细胞体外增殖活性及对靶细胞的杀伤作用，体内对NOD/SCID鼠荷肝癌细胞移植瘤的生长抑制作用，初步探讨CD105CART细胞抗肿瘤作用及机制，为肿瘤过继免疫细胞治疗提供新的依据。 方法：1.针对19号染色体AAVS1位点的PPP1R12C基因设计gRNA，构建CRISPR/Cas9载体，用T7E1方法验证设计的gRNA是否具有切割作用。构建胞外段含有CD105纳米抗体，共刺激分子为4-1BB及结构域为CD3ζ的二代CARs分子载入pLVX表达载体中，用双酶切进行鉴定。用PCR方法获取CAR片段，将CAR片段与Puc-Mdonor-AAVS1载体连接，构建两端带有1kb左右同源臂的外源基因的同源同组载体Puc-Mdonor-AAVS1-CAR。 2.将CRISPR/Cas9载体和同源重组载体采用电转染的方式导入到T淋巴细胞中构建CAR T细胞，细胞经过培养后用DNA提取试剂盒提取细胞DNA，PCR法验证CAR片段及左右同源臂，利用荧光显微镜观察是否有GFP的表达，流式细胞仪检测T细胞荧光GFP的表达率及分析CAR T细胞的CD4+CD8+比例。 3.经电转染获得CD105CAR T细胞、CD19CAR T细胞、Mock组T细胞，通过流式细胞仪检测CAR T细胞经过靶细胞刺激后的增殖情况，表面活性分子CD25、CD69，记忆分子CD62L，耗竭分子PD-1的表达以及溶酶体蛋白(CD107a)等的表达。 4.采用流式细胞仪检测CD105CAR T细胞对肝癌细胞Be17404、HepG2、SMCC7721、MHCC97H的杀伤作用，ELISA法检测CD105CAR T细胞分泌细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10等）的含量，ELISPOT检测CAR T细胞经靶细胞刺激后分泌IFN-γ的细胞数量。 5.构建NOD/SCID鼠荷肝癌移植瘤模型（Be17404及MHCC97H模型），经尾静脉注射CART细胞和未电转T细胞，共治疗2次，检测重组CAR T细胞体内杀伤肿瘤的能力，通过测量小鼠瘤体积大小，观察小鼠的生存率等指标判定CAR T细胞在体内的抗肿瘤作用。 6.当瘤长度达15mm时取瘤做石蜡切片，免疫组织化学染色法检测肿瘤组织中细胞增殖情况(Ki67)，检测肿瘤组织中的血管密度(CD31)，检测肿瘤组织中的凋亡蛋白(Bax)的表达，Tunel法检测肿瘤组织中凋亡细胞的数目，检测肿瘤组织中CD3的含量等研究CAR T细胞抗肿瘤机制。 结果：1.构建了CRISPR及Donor载体，运用CRISPR/Cas9技术制备CAR T细胞，PCR法验证CAR片段及左右同源臂在T细胞基因组中成功表达，荧光显微镜观察到GFP的表达，流式细胞仪检测T细胞荧光GFP的表达率在20％以上，表明成功制备CAR T细胞。 2.CD105CAR T细胞经靶细胞抗原刺激后能促进T细胞的增殖，促进表面活化分子(CD25、CD69)、记忆分子(CD62L)及溶酶体蛋白CD107a的表达。CD105CART细胞分泌细胞因子IFN-γ，TNF-α量增多，高于其他对照组，IL-10的分泌无差异。 3.在不同的效靶比下，随着效靶比的增大，杀伤作用增强，CD105CART细胞对靶细胞(Be17404、HepG2、SMCC7721)杀伤作用显著高于对照组CAR T细胞，对高表达CD105细胞(Bel7404、HepG2、SMCC7721)的杀伤效率高于低表达CD105的靶细胞(MHCC97H)，但是对于MHCC97H的杀伤效率与对照组没有显著的差异。 4.CD105CAR T细胞对正常小鼠组织器官无毒性，用CD105CAR T细胞治疗荷肝癌NOD/SICD小鼠，CD105CAR T细胞对CD105高表达及CD105低表达移植瘤均有一定的治疗作用，对CD105高表达移植瘤的治疗效果高于CD105低表达移植瘤，肿瘤生长受到抑制，延长小鼠的生存时间。 5.免疫组织化学检测表明CD105CAR T细胞能抑制肿瘤组织细胞增殖，降低肿瘤中血管密度，促进凋亡蛋白表达，凋亡细胞数量增多，并且小鼠瘤组织中有少量T淋巴细胞浸润，提高CD105CAR T细胞的抗肿瘤作用。 结论：研究结果显示，用CRISPR/Cas9技术在AAVS1位点成功构建CD105纳米抗体CAR T细胞，CD105CAR T细胞在体内体外具有一定的抗肿瘤作用，CD105CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用跟CD105的表达量有关，为肿瘤的过继治疗提供了新策略。