靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体T细胞抗肿瘤作用及机制研究

摘要

恶性肿瘤严重威胁人类健康，治疗恶性肿瘤是目前迫切需要解决的医学问题。目前，过继性免疫治疗已经成为手术、放疗、化疗、中医中药治疗之外一种新的恶性肿瘤治疗方法。基于嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞的过继性免疫治疗是当前研究的热点。由基因工程技术构建的CAR T细胞表面带有识别肿瘤特异性抗原的受体，可不经抗原提呈直接提供细胞活化信号，不受主要组织相容性复合物限制，能实现良好的肿瘤靶向性和细胞活性，发挥强效的抗肿瘤作用。CAR T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了巨大成功，2017年经FDA批准已有两个CAR T细胞类药物上市，用于急性淋巴细胞白血病和特定类型非霍奇金淋巴瘤患者治疗。但CAR T细胞治疗实体肿瘤的研究目前进展缓慢。实体瘤复杂的肿瘤微环境介导的免疫抑制是影响CART细胞疗效的主要因素。因此，从打破肿瘤微环境免疫抑制的角度，寻找更合适的肿瘤特异性抗原、更合适的抗体，以提高CAR T细胞的抗实体瘤疗效，具有重大的临床意义。 纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein，FAP)是活化的成纤维细胞胞膜上面一种Ⅱ型膜整合糖蛋白，高度特异性表达于绝大多数恶性肿瘤微环境中增生性的成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)，是CAF的特异性标志物之一。FAP具有特殊的生物学特性，在促进肿瘤生长、浸润、侵袭、转移、肿瘤免疫抑制中均扮演了重要角色。以FAP作为靶点针对肿瘤间质治疗实体瘤的免疫治疗正越来越受到关注。 纳米抗体是由骆驼血液中发现的重链抗体的可变区组成的一类单域抗体，具有高水溶性、高稳定性、高表达性、高产量、较强的组织穿透性和较弱的免疫原性等优点，在恶性肿瘤免疫靶向治疗方面展现出了广阔的应用前景。本课题组前期研究成功筛选出FAP特异性纳米抗体，命名为F578。该纳米抗体能与肿瘤细胞表面抗原FAP分子特异性性结合，能否应用于构建CART细胞实现抗肿瘤作用仍需进一步研究。 目的：探索应用抗FAP纳米抗体构建CAR T细胞的方法，验证FAP-CAR T细胞的体外增殖活性和对靶细胞的特异性杀伤作用，以及体内对小鼠皮下肝癌移植瘤的抑制作用，初步探讨FAP-CAR T细胞抗肿瘤作用及机制，为CAR T细胞治疗实体肿瘤提供新的依据。 方法：1.设计CAR基因序列，分别为Mock、CD19-CAR和FAP-CAR3组;双酶切方案切割PLVX慢病毒载体，完成目的基因与载体质粒连接;进行慢病毒的包装和浓缩，以荧光计数法计算慢病毒滴度。 2.分离培养人外周血T淋巴细胞，将收获的慢病毒应用于T细胞感染以完成CAR T细胞构建;荧光显微镜观察CAR T细胞的GFP表达情况;流式细胞术检测CAR T细胞表达GFP的比例和CD4+/CD8+比例。 3.收集人原发性肝癌组织，以消化差异法分离纯化肝癌组织中的CAF，通过流式细胞术检测FAP/α-SMA表达对CAF进行鉴定。 4.以未转染的T细胞(Utd)为对照，流式细胞术检测Utd组、Mock组、CD19-CAR组、和FAP-CAR组的CAR T细胞与靶细胞共孵育后的增殖情况;以及表面活化分子CD25、CD69，记忆分子CD62L，溶酶体蛋白CD107a和胞内IFN-γ的表达。 5.流式细胞术检测FAP-CAR T细胞对FAP+细胞系的体外杀伤情况;ELISA法检测上清液中的细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10）的含量。 6.构建HepG2-hFAP细胞小鼠皮下移植瘤模型，随机分为PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR T细胞和未转染T细胞后，观察CAR T细胞治疗对小鼠肿瘤的肿瘤体积、瘤重、以及小鼠存活时间的影响。 7.肿瘤长径达到15mm时，处死小鼠剥离肿瘤并制备石蜡切片。免疫组化法检测肿瘤组织的Ki-67抗原和FAP表达;TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡的数量;免疫荧光法检测肿瘤中的血管密度(CD34)。 8.构建HepG2-hFAP细胞小鼠皮下移植瘤模型，随机分为PBS、Utd、Mock、CD19-CAR和FAP-CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR T细胞和未转染T细胞后，流式细胞术检测各组第7、第14、第28天荷瘤小鼠外周血、脾脏、肿瘤组织中人CD3的表达情况。 9.取正常的NOD/SCID小鼠，分为FAP-CAR T组和PBS组。经尾静脉注射FAP-CAR T细胞治疗后，HE染色法检测其对小鼠主要脏器的毒性作用。 结果：1.应用双酶切方案成功完成PLVX慢病毒载体切割和基因重组，PCR法验证各组CAR基因均可成功插入载体;重组载体包装成慢病毒并浓缩后，最终收获的慢病毒滴度滴度达到2E+8TU/ml; 2.将这些慢病毒应用于T细胞感染后，荧光显微镜下观察到GFP荧光，流式细胞术检测到各组细胞的GFP表达均超过了40％，表明CAR T细胞制备成功。 3.流式细胞术对分离纯化后的CAF进行检测，FAP/α-SMA双阳性的细胞比例达到75.7％，提示CAF分离成功，可用于下一步实验。 4.FAP-CAR T细胞经FAP+靶细胞刺激后增殖活跃，增殖频率与倍数均明显高于其余对照组别;其细胞表面活化分子CD25、CD69，记忆分子CD62L，溶酶体蛋白CD107a和胞内IFN-γ表达较其余对照组别均出现明显上调。 5.FAP-CAR T细胞可在体外明显杀伤FAP+的靶细胞，并且其杀伤效果随着效靶比的升高而增强，对高表达FAP的CAF和HepG2-hFAP靶细胞杀伤比例高于低表达FAP的U87细胞，对FAP-的肿瘤细胞则没有杀伤作用。当与FAP+靶细胞共培养时，FAP-CAR T细胞上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的含量明显升高，IL-10的含量没有明显变化。 6.体内实验观察到FAP-CART细胞治疗可明显抑制HepG2-hFAP皮下移植瘤小鼠的肿瘤发展，并延长小鼠的生存时间、提高存活率;免疫组化法检测到小鼠肿瘤组织表达Ki-67和FAP的细胞比例明显降低;TUNEL法检测到小鼠肿瘤组织中凋亡细胞比例明显增加;免疫荧光法检测到小鼠肿瘤的血管密度明显降低。 7.FAP-CAR组小鼠的外周血、脾脏和肿瘤组织中CD3表达在三个时间点均明显高于其余对照组，在第14天时检测到CD3表达上升至峰值，到第28天时仍能保持一定表达。 8.HE染色法结果显示FAP-CAR T细胞治疗对小鼠的主要脏器无毒性作用。 结论：基于抗FAP纳米抗体构建的FAP-CART细胞可在体内外特异性靶向杀伤FAP+靶细胞，这种针对肿瘤微环境的CART细胞疗法为实体瘤的免疫治疗提供了新的思路。