X染色体失活与DMD女性携带者临床表型关系的研究

摘要

目的： 应用甲基化内切酶酶切法检测Duchenne肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)女性携带者X染色体失活情况，分析X染色体失活情况与DMD女性携带者临床表型的关系，探索DMD女性携带者不同临床表型的可能机制。 方法： 1.收集2011年9月至2017年8月于广西医科大学第一附属医院儿科就诊，经基因检测确诊的DMD患者及其携带基因突变的女性亲属的临床资料;根据肌酸激酶水平将女性携带者分为高肌酸激酶组和正常肌酸激酶组。 2.提取先证者及女性携带者外周血淋巴细胞DNA并测量其浓度及纯度;所有病例的DNA标本先进行甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ酶切/非酶切处理，然后扩增HUMARA基因片段，2％琼脂糖凝胶电泳后于化学发光成像系统下观察，Image Lab软件进行图像分析酶切实验是否成功。 3.Fam荧光标记引物PCR扩增酶切处理后DNA标本的HUMARA基因片段，应用ABI373自动测序仪进行毛细管电泳分离，荧光标记片段经Peak Scanner2.0进行分析，辨别失活X染色体及其父/母来源，根据基因片段荧光峰值计算X染色体失活比例，≥80％即为倾斜性失活。 4.应用SPSS22.0软件进行处理，采用完全随机设计两样本秩和检验、Spearman等方法分析统计实验数据，比较DMD女性携带者父/母来源X染色体失活、高肌酸激酶组和正常肌酸激酶组的差异，分析肌酸激酶水平与X染色体失活比例的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1.本研究共纳入38个DMD家系，包括男性DMD先证者40例，携带DMD基因突变的女性携带者57例，其中表现为肌酸激酶高的DMD女性携带者为36例(63.2％)，纳入高肌酸激酶组;表现为肌酸激酶正常的DMD女性携带者为21例(36.8％)，纳入正常肌酸激酶组。高肌酸激酶组中肌酸激酶最高值为7012U/L，最低值为183U/L，平均值1072.4U/L。 2.DMD先证者及女性携带者外周血DNA提取成功（浓度最高值125.8ng/ul，最低值21.1ng/ul，纯度范围在1.63-2.1之间）;所有标本酶切实验成功，即DMD先证者酶切组电泳结果为无条带，非酶切组出现一条清晰的条带，而DMD女性携带者酶切组和非酶切组均可见一条条带，且非酶切组条带浓度要高于酶切组。 3.ABI373自动测序仪毛细管电泳结果显示DMD先证者酶切组无明显峰值，非酶切组显示有一个峰值。DMD女性携带者酶切组和非酶切组均显示有两个峰值，其中一个峰值所在片段大小与非酶切组DMD先证者一致。本研究57例DMD女性携带者中30例为母源X染色体失活(52.6％);27例为父源X染色体失活(47.4％)。 4.比较DMD女性携带者母源X染色体失活组和父源X染色体失活组肌酸激酶水平，结果显示Z=-0.176，P=0.86＞0.05，可见母源X染色体失活组和父源X染色体失活组的肌酸激酶水平差异不具有统计学意义。比较DMD女性携带者高肌酸激酶组和正常肌酸激酶组X染色体失活比例，结果显示Z=-0.24，P=0.81＞0.05，可见高肌酸激酶组和正常肌酸激酶组的X染色体失活比例差异不具有统计学意义。分析X染色体失活比例与DMD女性携带者肌酸激酶水平的相关性，结果显示P=0.858＞0.05，可见X染色体失活比例与DMD女性携带者肌酸激酶水平不存在相关性。 结论： 1.本研究高肌酸激酶表现的DMD女性携带者占多数，然而不能单纯依靠肌酸激酶水平诊断DMD女性携带者身份，最终还是要依靠基因诊断明确遗传学身份。 2.母源X染色体失活组和父源X染色体失活组的肌酸激酶水平无明显差异，高肌酸激酶组和正常肌酸激酶组DMD女性携带者的X染色体失活比例无明显差异，且血清肌酸激酶水平与X染色体失活比例无明显相关性，可见DMD女性携带者失活X染色体来源及X染色体失活比例可能不是造成DMD女性携带者临床表型不同的原因。