黄芩苷联合利奈唑胺对金黄色葡萄球菌生物被膜干预作用的体内外研究

摘要

文章主要从以下几部分进行论述： 第一部分 黄芩苷联合利奈唑胺对金黄色葡萄球菌生物被膜干预作用的体外研究 目的:检测受试的金黄色葡萄球菌菌株能否形成生物被膜，构建稳定的体外生物被膜模型。探讨黄芩苷联合利奈唑胺对体外构建的金黄色葡萄球菌生物被膜的干预作用。 方法:广西医科大学第一附属医院提供的由临床分离获得的MRSA17546(t037型)为实验菌株，采用刚果红平板法定性该菌株能否形成生物被膜，同时采用硅胶膜作为建模载体，LB肉汤作为培养基，构建体外生物被膜模型，分别运用银染法及扫描电镜观察体外构建的金黄色葡萄球菌生物被膜的形态结构。运用二倍稀释法测定黄芩苷、利奈唑胺对MRSA17546的MIC。在体外构建3天及7天的金黄色葡萄球菌生物被膜模型，在第3天及第7天加入药物干预24小时，实验分组如下:空白组、黄芩苷组、利奈唑胺组、黄芩苷+利奈唑胺组。采用连续稀释法进行菌落计数，结晶紫半定量测定生物被膜量，扫描电镜观察生物被膜的形态。 结果:在刚果红平板上生长的金黄色葡萄球菌菌落变黑，菌落外周的刚果红培养基颜色消退，可定性受检测的MRSA17546为能形成生物被膜的阳性菌株。在24孔板里，LB肉汤作为培养基连续培养3天，采用银染法处理，在光学显微镜下可见磨玻璃状、云絮状的生物被膜，透光欠佳。连续培养7天，银染法处理后光学显微下可见更加致密的团块状、云雾状的生物被膜，透光度明显减低。扫描电镜观察到在硅胶膜表面，连续培养3天，形成早期的生物被膜，可见粘稠的细胞外基质，生物被膜内可见散在的金黄色葡萄球菌;连续培养7天，形成成熟的生物被膜，细胞外基质更多更粘稠，其中见较多的金黄色葡萄球菌。黄芩苷、利奈唑胺对MRSA17546的MIC值分别为2048μg/mL、2μg/mL。连续稀释活菌计数及结晶紫半定量测定生物被膜量结果显示:无论是早期（3天）还是成熟（7天）的生物被膜，黄芩苷单独干预组及利奈唑胺单独干预组与空白对照组比较，差异没有统计学意义（P＞0.05）;但是黄芩苷联合利奈唑胺治疗组与空白对照组、黄芩苷组、利奈唑胺组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。扫描电镜显示黄芩苷联合利奈唑胺组的载体表面生物被膜的细胞外基质及生物被膜内的金黄色葡萄球菌明显减少。 结论:1、临床菌株MRSA17546能形成金黄色葡萄球菌生物被膜。2、以硅胶膜为载体，LB肉汤为培养基，MRSA17546能在体外形成稳定的金黄色葡萄球菌生物被膜。3、黄芩苷可破坏金黄色葡萄球菌生物被膜，可协同利奈唑胺进入生物被膜内杀灭其中的金黄色葡萄球菌。 第二部分 构建金黄色葡萄球菌生物被膜的动物体内模型 目的:探讨构建金黄色葡萄球菌生物被膜动物体内模型，为后续药物干预体内实验提供基础。 方法:以临床分离获得的MRSA17546为实验菌株，分别建立大鼠背部皮下羧甲基纤维素钠空气囊袋感染模型及硅胶膜植入大鼠背部的感染模型。在建模后不同时间点分别采用连续稀释活菌计数法定量分析生物被膜内细菌数量及扫描电镜法观察生物被膜的形态。 结果:连续活菌计数表明:羧甲基纤维素钠空气囊袋感染模型的生物被膜内细菌数量变化较大，硅胶膜植入模型构建的生物被膜膜内细菌数量随着时间延长处于相对稳定。扫描电镜观察显示:羧甲基纤维素钠囊袋模型观察到的较多粘稠样物质，而且难以与细菌生物被膜区分开。硅胶膜植入模型载体表面可看见较典型的金黄色葡萄球菌生物被膜。 结论:羧甲基纤维素钠空气囊袋感染模型及硅胶膜植入大鼠背部的感染模型均可成功模拟构建金黄色葡萄球菌生物被膜的动物感染模型。后一种模型更为简便、稳定。因此后续的药物干预作用采用该模犁。 第三部分 黄芩苷联合利奈唑胺对金黄色葡萄球菌生物被膜干预作用的体内研究 目的:探讨黄芩苷联合利奈唑胺对体内构建的金黄色葡萄球菌生物被膜的干预作用。 方法:以广西医科大学第一附属医院临床分离获得的MRSA17546为实验菌株，建立硅胶膜植入大鼠背部感染模型。建模当天立即给与药物干预，分为空白组、黄芩苷组、利奈唑胺组、黄芩苷联合利奈唑胺组。在建模后第1、2、3天采用连续稀释活菌计数法进行定量分析，采用扫描电镜观察细菌生物被膜形态，直接肉眼观察背部局部组织炎症反应表现，硅胶膜周围组织用HE染色后进行组织病理学观察，腹腔采血后行炎症因子PCT、CRP含量检测。 结果:连续稀释活菌计数结果表明:给与药物干预1天后，黄芩苷组、利奈唑胺组生物被膜内细菌载量与空白组比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。黄芩苷联合利奈唑胺组与其它组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。药物干预2天后，黄芩苷组与空白组比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。利奈唑胺组与空白组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。黄芩苷联合利奈唑胺组与利奈唑胺组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。药物干预3天后，各组生物被膜量较前均有减少，黄芩苷联合利奈唑胺组与空白组及各单药组单独比较，差异具有统计学差异(P＜0.05)。扫描电镜观察结果显示:药物干预作用1天后，空白组、黄芩苷组、利奈唑胺组载体表面可见较多的粘稠样物质及细菌，彼此所见大致相同。而黄芩苷联合利奈唑胺明显可以减少粘稠样生物被膜形成，膜内细菌明显减少。药物作用干预2、3天后，黄芩苷组载体表面生物被膜量与空白组相比仍没有减少，利奈唑胺组载体表面粘稠样物质及细菌比空白组、黄芩苷组有所减少，联合药物干预组载体表面看到的生物被膜及细菌明显减少。肉眼观察植入载体周围组织结果显示，给与药物干预后，利奈唑胺可减轻植入物周围组织充血、渗出、水肿等炎症反应。黄芩苷联合利奈唑胺更能进一步减轻植入物周围组织的急性炎症反应，到第3天观察到植入物周围组织几乎无充血、渗出。组织活检HE染色观察到联合用药组镜下可见的炎症细胞明显减少，随着时间推移，可见较多泡沫样细胞及成纤维组织。腹腔采血测定炎症因子结果表明，联合药物干预组能明显减轻全身炎症反应，CRP、PCT含量与单药组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论:黄芩苷联合利奈唑胺能明显破坏并减少大鼠体内金黄色葡萄球菌生物被膜，可有效减轻生物被膜相关感染导致的炎症反应。