广西甜茶提取物成分及降血糖作用研究

摘要

广西甜茶(RubusSuavissimus S.Lee)是广西特有的茶、糖、药三位一体的甜味植物，主产于柳州、桂林、梧州等地，具有“清热降火、生津、润肺、祛痰、止咳”等功效。近年来，随着社会的发展和人民生活方式的改变，糖尿病发病率有着上升的趋势，严重威胁人类的生活质量。当前主要通过口服降血糖药物和注射胰岛素的方式进行治疗。广西甜茶作为天然降血糖植物，在广西多地使用历史悠久，本研究主要通过对广西甜茶成分提取分离及含量测定并对部分成分进行功效研究来进一步丰富甜茶的应用谱，从而达到更好的开发利用甜茶资源的目的。 1、以广西甜茶叶为原料，先将广西甜茶通过水提法和醇提法两种方法进行粗提取，并利用高效液相色谱法测定分析了广西甜茶水提物和不同醇提物甜茶苷含量，结果为广西甜茶（荔浦产地）水提物和各浓度醇提物甜茶苷浓度分别为:1.46mg/g、3.33mg/g、14.34mg/g和15.64mg/g（提取溶剂分别为水、30％乙醇、50％乙醇和75％乙醇）。根据实验结果选择提取方法（即醇提法）对四个产地包括金秀、新坪、蒲芦、荔浦甜茶进行甜茶苷含量测定比较。结果表明:金秀、新坪、蒲芦的甜茶中甜茶苷含量分别为21.76mg/g，69.01mg/g，23.79mg/g（提取溶剂为95％乙醇）。荔浦产地中各浓度醇提物中75％乙醇提取的甜茶苷含量最高。 2、将广西甜茶醇提物部分加水溶解，过滤上101大孔树脂柱过滤，分别用10％、40％、60％、95％乙醇进行梯度洗脱，得各部分甜茶总提物。再不断经过硅胶柱层析、凝胶柱、聚酰胺柱和重结晶等方法，经过光谱鉴定，从各浓度乙醇提取物中分离出甜茶苷、金丝桃甙、山奈酚、蔗糖等4个化合物。 3、研究广西甜茶醇提物分别对正常小鼠和糖尿病小鼠血糖及糖耐量的影响。糖耐量测试方法:将正常KM小鼠分为空白组、广西甜茶醇提物高、中、低(250，150，100g·kg-1)等四组剂量组，连续灌胃给药40d，观察其对正常小鼠血糖的影响。糖耐量测定每隔10d测一次，提前一天空腹，各组均腹腔注射10％葡萄糖溶液，通过血糖仪和血糖试纸分别测定注射葡萄糖前(0h)血糖值以及注射葡萄糖溶液后0.5，1，2h的血糖值。糖尿病小鼠实验:通过链脲佐菌素STZ尾静脉注射诱导的KM小鼠2型糖尿病模型初步研究广西甜茶各浓度醇提物的降血糖作用，将成模SPF级KM小鼠100只随机分成模型组，二甲双胍组(0.25g·kg-1·d-1)，甜茶30％、50％、75％各浓度醇提物分为高、中、低剂量组，另取十只做正常组，灌胃给药4周，每周测一次血糖。观察体重毛发等一般指标。实验结果显示广西甜茶醇提物低剂量组和中剂量组对正常小鼠空腹血糖有显著影响，并随着给药时间的增长，对葡萄糖致小鼠高血糖有一定的抑制作用(P＜0.01，P＜0.05)，同时与空白对照组相比低剂量组和中剂量组给药40d后体重有明显的降低。各浓度醇提物中75％无水乙醇提取的甜茶素含量最高，其中75％醇提物提取物能极显著地降低小鼠血糖。 4、研究广西甜茶水提物的降糖作用。方法:通过链脲佐菌素STZ尾静脉注射诱导的KM小鼠二型糖尿病模型初步研究广西甜茶水提物的降血糖作用。将成模SPF级KM小鼠50只随机分成模型组，二甲双胍组(0.25g·kg-1·d-1)，甜茶水提物高、中、低剂量组，另取十只做正常组，灌胃给药4周，每周测一次血糖，第四周取小鼠肝脏血清检测肝肌糖元，SOD(超氧化物歧化酶)，MDA（丙二醛）等指标初步判断广西甜茶水提物的降糖作用。结果:与空白组相比，模型空白组FBG水平较高，肝组织中的MDA较高，肝糖原、SOD水平低，均具有明显统计学差异(P＜0.05);与模型组相比，甜茶水提物给药组和阳性药二甲双胍组FBG水平明显降低，SOD活性升高，肝糖原含量增加，MDA含量降低，均具有明显统计学差异(P＜0.05)说明肝组织增强其抗氧化能力。结论:甜茶水取物能降低糖尿病小鼠的血糖，其机制可能与肝脏的抗氧化能力有关。 5、广西甜茶醇提物血中移行成分的初步分析。将广西甜茶叶通过95％乙醇提取3次，每次1h，合并浓缩后得广西甜茶95％醇提物。将95％醇提物经凝胶柱层析通过85％甲醇水洗脱除杂后上HPLC-MS进行分析。另取SD大鼠5只，分为空白对照组、95％醇提组，禁食12h，称重，按照1.5ml/100g，分别灌胃蒸馏水、95％醇提物药液，除了空白组，95％醇提组分别在30、90、150、210min取血，4000rmp离心10min，将血清样品分装，通过蛋白沉淀后上HPLC-MS分析确定最佳采血时间。通过建立广西甜茶醇提物化学成分体内外HPLC-MS分析方法，在此基础上比较分析广西甜茶醇提物提取液HPLC和血清样品HPLC色谱图，根据各成分保留时间确定进入血液原型成分和代谢转化成分。