红树林胰α-淀粉酶抑制剂产生箘的分离筛选

摘要

α-淀粉酶抑制剂(α-Amylase Inhibitor，AI)是一种能够抑制α-淀粉酶活性的糖苷酶抑制剂，在药学和农业方面均有广泛应用。在药学方面，α-淀粉酶抑制剂主要用于防治糖尿病、高血脂和肥胖症等疾病;在农业方面，α-淀粉酶抑制剂可制备成生物农药或者利用转基因技术改良植物的抗虫性。
　　本论文对广西北仑河口国家级自然保护区海水、海泥及红树林植物土壤中的微生物进行α-淀粉酶抑制活性菌株的分离筛选，并根据其形态特征、生理生化特征以及16srDNA序列分析来对菌株进行初步的鉴定，同时优化该目的菌株的发酵条件，以期达到提高该菌株发酵产物中的α-淀粉酶抑制剂含量。在此基础上，对筛选出的目的菌株的发酵液进行纯化处理，采用大孔树脂法、薄层层析法及硅胶层析法筛选出对α-淀粉酶抑制率最高的活性部位和成分，通过化学成分预试验的方法初步确认活性成分。
　　本论文采用稀释涂布分离法从红树林土壤（采自广西北仑河口国家级自然保护区）中筛选到137株菌株。其发酵液经过琼脂平板打洞法初筛得到9株对胰α-淀粉酶产生抑制效果的菌株T1～T9。然后采用Bernfeld法对菌株T1-T9进行复筛，同时以阿卡波糖作为阳性对照，发现来自于红树林植物白骨壤的根部土壤中的T2菌株具有最好的抑制效果，其发酵原液对胰α-淀粉酶的抑制率为34.88％。1mg/mL的阿卡波糖对胰α-淀粉酶的抑制率为37.43％。
　　对目的菌株进行了形态特征、培养特征以及生理生化特征鉴定。将目的菌株T2接种到Zobell-2216E培养基上，恒温培养5d后，形成直径约为4mm的白色而微微带点透明的菌落。10d后再次观察发现，菌落表面干燥而多皱，菌落反面为黄色，带有泥腥味。菌落与培养基结合紧密，不易挑取。将目的菌株T2接种到多种培养基上进行培养特征鉴定，观察发现该菌株能够使明胶液化，牛奶凝固与胨化，能够使硝酸盐还原和淀粉水解，不能产生H2S和水解纤维素。能够吸收利用葡萄糖、蔗糖、黄豆粉、甘露醇、肌醇这五种碳源。然后提取目的菌株的16srDNA进行序列测定，测定结果与GenBank文库中的序列进行比对，结果发现目的菌株T2的16SrDNA序列与EU570682.1 Streptomyces sampsonii和AB249937.1 Streptomyces globisporus这两个模式种的序列同源性很高，高达98％;目的菌株T2与EU570682.1 Streptomyces sampsonii处于同一分支中，结合菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征、16SrDNA鉴定，初步鉴定目的菌株T2为链霉菌科链霉菌属的微生物。
　　通过单因素试验和正交试验来探究目的菌株T2的发酵条件。结果表明目的菌株T2能够利用的较佳碳源和氮源分别是葡萄糖和蛋白胨，在正交试验时发酵时间、培养温度、初始pH值和装瓶量这四个发酵条件中，对菌株产α-淀粉酶抑制剂量的影响主次顺序为发酵时间＞装瓶量＞温度＞初始pH值，其中发酵时间对菌株产α-淀粉酶抑制剂量的影响最大。各因素最优水平为:A2(发酵时间168h)，B2（温度28℃），C3（初始pH7.5），D1（装瓶量70mL）。利用最优组合A2B2C3D1进行发酵，所获得的发酵原液取0.25mL进行α-淀粉酶的抑制率测定，发现其对α-淀粉酶的抑制率表现最高为57.43％。
　　采用超声波法（分别选用水、乙醇、石油醚作为溶剂）辅助提取发酵液活性成分，进行抑制活性测定。结果发现水相浓缩液对α-淀粉酶的抑制率最高为70.32％（相当于9.65mL的发酵原液）;醇提液浓缩液对α-淀粉酶的抑制率为17.13％（相当于2.35mL的发酵原液）;石油醚萃取浓缩液对α-淀粉酶的抑制率为6.73％（相当于0.92mL的发酵原液）;可见目的产物的极性比较大，选用水相进行后续实验。在对水相纯化过程中，选用五种大孔吸附树脂，比较后选用大孔吸附树脂D101进行第一步纯化，结果发现用水洗脱的组分抑制率最高，对α-淀粉酶的抑制率达到67.43％（相当于9.26mL的发酵原液）。其次是20％乙醇洗脱液的组分，对α-淀粉酶的抑制率为21.18％（相当于2.91mL的发酵原液）。对水洗脱的组分采用硅胶柱层析的方法进行进一步的纯化，通过薄层层析筛选其溶剂洗脱系统进行洗脱，结果表明，用氯仿∶甲醇系统（比例为3∶1）进行洗脱，可获得对α-淀粉酶的抑制率最大为81.69％的组分（相当于11.22mL的发酵原液）。同时，1mg/mL的阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率为78.32％。比较后发现，经多次纯化后的发酵液对α-淀粉酶的抑制效果要好于1mg/mL的阿卡波糖。将收集的组分进行减压浓缩后得到浸膏，进行化学成分预实验，初步确定组分中的主要成分是糖苷类和蛋白质类物质。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1．1 糖尿病的现状

1．2 糖尿病的类型

1．2．1 Ⅰ型糖尿病

1．2．2 Ⅱ型糖尿病

1．2．3 妊娠合并糖尿病

1．3 糖尿病的危害

1．3．1 对心脑血管的危害

1．3．2 对肾脏的危害

1．3．3 对神经的危害

1．3．4 对眼球的危害

1．3．5 对物质代谢的危害

1．4 糖尿病的治疗方法

1．4．1 饮食疗法

1．4．2 运动疗法

1．4．3 药物疗法

1．5 α-淀粉酶抑制剂国内外研究概况

1．5．1 植物源α-淀粉酶抑制剂

1．5．2 菌源性α-淀粉酶抑制剂

1．5．3 α-淀粉酶抑制剂的应用前景

1．5．4 红树林的研究意义

1．6 本课题主要内容和研究意义

1．6．1 主要研究内容

1．6．2 本课题研究意义

第2章 α-淀粉酶抑制剂产生菌株的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 样品采集

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 红树林微生物菌株分离

2．2．2 发酵液预处理

2．2．3 α-淀粉酶抑制剂活性菌株初筛

2．2．4 α-淀粉酶抑制剂活性菌株复筛

2．2．5 阳性对照实验

2．3 实验结果

2．3．1 红树林微生物菌株分离结果

2．3．2 胰α-淀粉酶抑制剂产生菌的初筛结果

2．3．3 胰α-淀粉酶抑制剂产生菌的复筛结果

2．4 本章小结

第3章 α-淀粉酶抑制剂产生菌的分类和鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 实验菌种

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 培养基

3．1．4 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 菌株形态及培养特征鉴定

3．2．2 菌株生理生化特征鉴定

3．2．3 菌株16SrDNA序列分析和系统发育树比对

3．3 实验结果

3．3．1 培养特征与形态特征观察

3．3．2 目的菌株T2生理生化特征鉴定

3．3．3 目的菌株16SrDNA的序列测定

3．4 本章小结

第4章 α-淀粉酶抑制剂产生菌发酵条件的优化

4．1 实验材料

4．1．1 实验菌种

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 主要试剂

4．1．4 培养基

4．2 实验方法

4．2．1 种子培养

4．2．2 发酵培养

4．2．3 培养基碳源筛选

4．2．4 培养基氮源筛选

4．2．5 发酵时间的优化

4．2．6 发酵温度的优化

4．2．7 初始pH值的优化

4．2．8 装瓶量的优化

4．2．9 正交实验法优化发酵培养基配方

4．3 实验结果

4．3．1 碳源的筛选

4．3．2 氮源的筛选

4．3．3 发酵时间的优化

4．3．4 发酵温度的优化

4．3．5 初始pH值的优化

4．3．6 装瓶量的测定

4．3．7 正交试验结果与分析

4．4 本章小结

第5章 α-淀粉酶抑制剂纯化方法的研究

5．1 实验材料

5．1．1 实验样品

5．1．2 主要仪器

5．1．3 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 发酵液的预处理

5．2．2 超声波法辅助提取发酵液活性成分

5．2．2 大孔吸附树脂的预处理

5．2．3 大孔吸附树脂的筛选

5．2．4 大孔吸附树脂法初步分离

5．2．5 硅胶柱层析洗脱溶剂的选择

5．2．6 硅胶柱层析进一步纯化发酵液

5．3 本章小结

第6章 总结与展望

6．1 主要结论

6．2 存在的问题

6．3 展望

参考文献

致谢