酵母耐铜蛋白基因CUP1在大肠肝菌和毕赤酵母的表达

摘要

金属硫蛋白一是类低分子量、富含半胱氨酸残基的金属结合蛋白,主要参与微量元素 的贮存、运输和代谢,具有拮抗电离辐射,清除羟自由基及重金属解毒作用.在生物药学、贵重金属回收、环境保护等领域具有广阔的应前景.该研究通过长引物PCR人工合成了包含copper box和转录起始位点的大肠杆菌质粒pRJ1004的抗铜启动子PpcoE,并将该启动子与附 加有SD序列的酵母耐铜基因CUP1的编码框相拼接,构建了CUP1基因的原核表达质粒pUC119-AB2.将pUC119-AB2分别转化进大肠杆菌DH5α、JM109和JM109(DE3),对得到的转化子分别进行铜诱导表达.SDS-PAGE分析没有观察到CUP1基因的表达产物.该研究研究了CUP1基因在毕赤酵母中的表达.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1金属硫蛋白的结构

1.2金属硫蛋白的种类

1.3金属硫蛋白的功能

1.4金属硫蛋白的应用

1.5酵母耐铜基因CUP1

1.6本工作的目的

第二章CUP1基因在大肠杆菌中的表达

2.1材料与方法

2.1.1菌株及质粒

2.1.2 PCR反应

2.1.3培养基及培养条件

2.1.4溶液、缓冲液和试剂

2.1.5 DNA的沉淀

2.1.6 DNA溶液中蛋白质及RNA的去除

2.1.7 DNA的提取

2.1.8质粒DNA的转化

2.1.9琼脂糖凝胶电泳

2.1.10电洗脱法回收DNA片段

2.1.11 DNA的连接

2.1.12 ABI DNA自动测序系统测定DNA序列

2.1.13铜诱导表达

2.1.14蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2结果与分析

2.2.1抗铜启动子的合成及克隆

2.2.2 CUP1基因编码框的5'的修饰I、改造

2.2.3铜诱导启动子与带有SD序列的CUP1基因编码框的拼接

2.2.4 pUC119-AB2的铜诱导表达

2.3讨论

第三章CUP1基因在毕赤酵母中的表达

3.1材料与方法

3.1.1菌株与质粒

3.1.2 PCR引物及反应条件

3.1.3培养基与试剂

3.1.4电脉冲转化Pichia

3.1.5体内筛选多拷贝插入(方法一)

3.1.6体内筛选多拷贝插入(方法二)

3.1.7 PCR直接筛选Pichia克隆

3.1.8 Mut+的胞内或分泌表达

3.1.9 Muts的胞内或分泌表达

3.1.10微量离心过滤浓缩蛋白质样品

3.2结果与分析

3.2.1表达载体pPIC9K-CUP1的构建

3.2.2 Pichiapastoris GS115的转化

3.2.3体内筛选多拷贝整合

3.2.4 CUP1在Pichia中的表达

3.3讨论

参考文献

致谢

附录