禽呼肠孤病毒感染流行病学调查与广西地方分离株S1基因的测序和克隆

摘要

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)的感染在世界各地均有发生,其中的鸡的关节炎/腱鞘炎是由ARV导致的最重要的疾病.此外,ARV感染更多的是导致腹泻、消化道功能紊乱、饲料转化率低、羽毛生长差,以及生长缓慢等病征.同时,ARV的感染也可引起免疫抑制,导致并发和或继发的疾病,给养鸡业造成了严重的危害.近年来越来越受到养禽业者和研究人员的重视.课题分别对ARV的反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)快速诊断方法、病毒的分离和鉴定、流行病学的调查、以及广西地方分离株S1基因的核苷酸序列等进行了研究.参考已经发表的ARV参考毒株S1133 S1基因cDNA的序列,合成了两套引物AR1、AR2、AR3和S1A、S1H,分别扩增ARV S1基因的ORF1-ORF2和ORF3.首先,应用引物AR1、AR2进行基础RT-PCR,扩增到534bp的目的片段,然后应用引物AR1、AR3进行半巢式PCR,扩增到393bp的目的片段.两个扩增片段横跨S1基因中大部分的ORF1和ORF2;应用引物S1A、S1H扩增到1022bp的目的片段,此片段包含S1基因中完整的ORF3,它编码病毒重要的σ 3蛋白.而与此同时,对其它常见禽病病原却均未能扩增到相应的片段.应用建立的RT-PCR快速诊断方法直接对来自广西、安徽和山东的102份临床疑似ARV感染鸡的病料进行检测,结果有14份鉴定为阳性(阳性率为13.73％).对RT-PCR快速诊断方法检测为阳性的14份临床病料进行ARV分离培养的研究.所采集的病料包括肝、脾、肌腱、胸腺、骨髓、法氏囊等,用常规方法处理,分别经卵黄囊、绒毛尿囊腔接种7天龄的无特定病原(specific-pathogen-free,SPF)鸡胚.结果成功分离到4株广西地方毒株;经对比发现,以卵黄囊接种的途径进行ARV的分离效果较好.研究还分别对广西地方分离株SH004、JD2和NN263、NN344 S1基因的两个扩增片段进行核苷酸序列的测定与克隆.SH004、JD2株534bp片段核苷酸的序列经与GenBank上发表的ARV参考毒株核苷酸序列进行同源性分析比较,发现SH004株与参考毒株S1133同源性最高,为99.6%;而JD2株与ARV参考毒株的同源性都较低,仅为79.1%-89.3%.同时还对SH004、JD2株及ARV参考毒株相应的p10、p17蛋白编码基因序列进行比对和分析.NN263株和NN344株完整的σ 3蛋白编码基因被成功克隆到pMD18-T质粒载体中,为进一步的研究奠定了基础.

目录

前言

文献综述 禽呼肠孤病毒研究进展

实验研究之一 禽呼肠孤病毒感染RT-PCR诊断方法的建立

实验研究之二 禽呼肠孤病毒感染流行病学调查及病毒的分离培养

实验研究之三 禽呼肠孤病毒广西分离株的序列分析及σ 3蛋白基因克隆

结论

致谢

个人简历

攻读学位期间发表的学术论文