山羊痘病毒P32基因跨膜区缺失载体的构建与表达

摘要

本课题首先建立了羊痘与羊口疮二重PCR诊断方法，试验表明该方法特异性强、敏感性高，可检测到4pg的DNA模板，能很好区分症状相似的山羊痘和羊口疮，本试验检测了7份疑似山羊痘病料，检出山羊痘阳性6份，羊口疮阳性1份。对广西山羊痘6份阳性病料和国内现用的山羊痘疫苗株的p32蛋白的全基因进行了PCR扩增、克隆和测序，并将序列上传至Genbank中(序列号分别是EF522176、EF522177、EF522178、EF522179、EF522180、EF522181)．序列分析结果表明，广西分离株之间的核苷酸同源性99.4-100％，推导的氨基酸同源性为98.1-99.7％，山羊痘广西分离株与哈萨克斯坦AY077835、 NC004003以及印度的AY382369、AY159333和中国哈尔滨的AY881707分离株的核苷酸同源性为99.6-99.9％，推导的氨基酸同源性为98.8-99.7％；与国内使用的疫苗株的核苷酸同源性为99.3-99.8％，推导的氨基酸同源性为97.8-99.4％；广西分离株、哈萨克斯坦的AY077835、NC004003，印度的 AY382369、AY159333和中国哈尔滨的AY881707与现用的疫苗株相比，在34-35位都缺失了2个氨基酸；广西分离株核苷酸6151位的碱基全部由T变为C，647-652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA，多了1个限制性内切酶Bsp1407I位点，而疫苗株和国内及国外的AY077835、NC004003、AY382369、 AY159333、AY881707在647-652位核苷酸都没有该限制性内切酶酶切位点，因此用限制性内切酶Bsp1407I可以区分疫苗株与广西分离株，本文建立了PCR-RFLP方法，疫苗株可以切成135bp和604bp两个片段，广西分离株可以切成135bp、226bp和378bp三个片段。为了进一步研究P32基因，本研究利用重组PCR技术消除P32基因跨膜区，用DNAstar软件对跨膜区缺失前后的蛋白图谱分析可知，跨膜区缺失前后的蛋白跨膜区位置的折叠构象、螺旋发生了一定变化，但抗原性在缺失前后未见变化，因此构建了一个缺失片段的重组质粒pGEX-S6，把该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导进行原核表达，经SDS-PAGE检测表达产物，结果显示检测到P32基因的表达产物，用BandScan软件对表达产物分析，优化反应条件，最佳诱导时间为5h，IPTG最佳诱导浓度是0.8mmol/I，最佳诱导温度是37℃，优化后表达的蛋白占菌体蛋白的29.4％，表达产物以融合蛋白的形式存在，融合蛋白出现在沉淀中，分子量为58KDa，Western-blot分析结果显示，表达产物可被山羊痘标准阳性血清识别。

目录

声明

摘要

前言

第一章研究综述

1.病原

1.1病毒的分类及形态

1.2病毒的理化特性及生物学特性

1.3病原性

1.4病毒的分离培养

2.病毒的基因组结构

2.1GPV与SPV

2.2GPV与LSDV

2.3GPV野毒与疫苗毒

2.4 GPV与ORFV(羊口疮病毒)

3.病毒进入细胞的机制

3.1脱膜过程

3.2早期基因的表达

3.3 DNA的复制

3.4晚期基因的表达

3.5病毒粒子的组装

3.6病毒的传播

4.发病机理

5.临床症状

6诊断方法研究情况

6.1临床诊断

6.2实验室诊断

7.疫苗

8.P32基因研究进展

9.山羊痘流行情况

9.1国外流行情况

9.2国内山羊痘流行情况

9.3广西山羊痘流行情况

10.本课题研究的目的与意义

第二章试验内容

1.材料

1.1病料

1.2菌种及载体

1.3血清及抗体

1.4主要试剂及配制

1.5感受态细胞的制备（CaCl2法）

1.6参考毒株

1.7引物

1.8技术路线

2.方法

2.1山羊痘和羊口疮二重PCR检测方法的建立

2.2山羊痘病毒P32基因的克隆、测序与序列分析

2.3 PCR-RFLP实验

2.4山羊痘病毒缺失载体的构建及表达

3.实验结果

3.1山羊痘和羊口疮二重PCR检测方法的建立

3.2山羊痘病毒P32基因的克隆、测序

3.3疫苗株与广西分离株PCR-RFLP结果

3.4山羊痘病毒P32基因跨膜区缺失载体的构建与表达

4讨论

4.1山羊痘和羊口疮二重PCR检测方法

4.2序列测定结果

4.3重组PCR

4.4表达系统

4.5 P32蛋白

5.结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的论文