蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2催化活性域的底物特异性研究

摘要

SHP—1和SHP—2都属于非受体样的蛋白酪氨酸磷酸酶，在细胞磷酸化调控的信号转导途径中起着非常重要的作用。尽管SHP—1和SHP—2在基因序列上有55％的同源性，SHP—1/SHP—2在机体内却各自具有不同的生物学功能：SHP—1主要在造血细胞和上皮细胞中表达，在信号转导中主要起负调控作用；而SHP—2则在各种类型的细胞中都有表达，在信号转导中主要起正调控作用。研究表明SHP—1/SHP—2通过对其底物的特异选择及作用，来实现其对细胞信号转导通路的选择，进而对细胞间通信、细胞生长和增殖、细胞周期调控、分化、细胞迁移产生影响。那么，SHP—1/SHP—2是如何在众多的底物中选择各自的特异性底物，并发挥其相应的生物学功能的机制至今未见有详实的报道。此问题引起了相关领域研究人员的极大关注。
　　 课题组的前期研究发现，除SHP—1/SHP—2催化活性域的中心裂隙外，催化活性域的β5—loop—β6区域内存在3个有区别的氨基酸残基，对SHP—1/SHP—2催化活性域的底物特异性选择有重要影响。基于此本课题拟通过HPLC纯化获得SHP—1/SHP—2的催化活性域蛋白(D1C/D2C)及其突变体蛋白(D1C3M、D1C4M、D2C3M和D2C4M)，然后分别以合成的磷酸化酪氨酸(PY)、表达纯化的单磷酸化位点PZR YS/Y6和SPAP2a Y1—Y4蛋白为反应底物，来分析D1C/D2C及其突变体的底物特异性，从而确证出D1C/D2C的单磷酸化特异性底物；并进一步揭示SHP—1/SHP—2催化活性域β5—loop—β6区域内3个有区别的氨基酸残基对D1C/D2C底物特异性的影响。
　　 首先，为了获得大量纯化D1C/D2C及其各突变体的蛋白。试验中D1C/D2C及其各突变体的菌株，经IPTG诱导表达、菌体裂解缓冲液悬浮和超声波破碎后，通过HPLC分离纯化D1C/D2C及其各突变体的蛋白，所得产物进行SDS—PAGE电泳检测。结果表明：(1)成功地表达了D1C/D2C及其各突变体蛋白，分子量大小分别为34.6KD和35.3KD，且各蛋白均以可溶性的方式进行表达。(2)通过HPLC技术可有效地分离纯化出大量的D1C/D2C及其各突变体蛋白。
　　 其次，对D1C/D2C及其各突变体蛋白的酶动力学特性进行初步探讨，为后续的底物特异性研究奠定了理论基础。试验中以PY作为去磷酸化反应的底物，利用孔雀绿显色法，通过双倒数作图法对纯化的D1C/D2C及其各突变体蛋白进行酶动力学特性分析。结果表明：(1)纯化的D1C/D2C及其各突变体蛋白均具有磷酸酶活性。(2)纯化的D1C、D1C3M和D1C4M，D2C和D2C3M的酶动力学反应常数基本一致，D2C4M发生较大变化。(3)D1C及其突变体的磷酸酶活性要高于D2C/D2C3M约1.5—2倍。
　　 然后，为了获得单磷酸化的PZR Y5/Y6蛋白，用于D1C/D2C及其各突变体的底物特异性分析。本试验以His—PZR原核表达载体为模板，利用特异的点突变引物，经PCR重叠延伸法扩增获得单磷酸化位点的PZR Y5/Y6片断，并分别构建其相应的原核表达载体。构建好的重组质粒与C—Src原核表达载体共转化大肠杆菌BL21菌株，并通过IPTG诱导目的蛋白表达，表达产物进行SDS—PAGE和Western—Blot检测。检测的表达菌体利用裂解液悬浮和超声波破碎后，经Ni—NTA琼脂糖凝胶纯化单磷酸化的PZR Y5/Y6蛋白。所得纯化产物通过Western—Blot和孔雀绿显色法用于D1C/D2C及其各突变体的底物特异性分析。结果表明：(1)已成功地表达了单磷酸化的PZR Y5/Y6蛋白，分子量大小为9.14KD，且蛋白均以可溶性的方式进行表达。(2)磷酸化的PZRY5/Y6是D1C的特异性底物。(3)D2C3M在一定程度上实现了底物特异性的转变，催化活性较D2C强，介于D1C和D2C之间。
　　 最后，为了获得单磷酸化的SPAP2aY1—Y4蛋白，用于D1C/D2C及其各突变体的底物特异性分析。本试验分别以GST—SPAP2a Y1—Y4原核表达载体DNA为模板，利用含6×His—Tag融合标签的突变引物，经PCR扩增获得含6×His—Tag融合标签的单磷酸化位点的SPAP2a Y1—Y4片断，并分别构建其相应的原核表达载体。构建好的重组质粒与C—Src原核表达载体共转化大肠杆菌BL21菌株，并通过IPTG诱导目的蛋白表达，表达产物进行SDS—PAGE和Western—Blot检测。检测的表达菌体利用裂解液悬浮和超声波破碎后，经Ni—NTA琼脂糖凝胶纯化单磷酸化的SPAP2aY1—Y4蛋白。所得纯化产物通过Western—Blot检测用于D1C/D2C及其各突变体的底物特异性分析。结果表明：(1)已成功地表达了含6×His—Tag融合标签单磷酸化的SPAP2aY1—Y4蛋白，分子量大小为16.8KD，且蛋白均以可溶性的方式进行表达。(2)磷酸化的SPAP2a Y1、Y2和Y4是D1C的特异性底物，磷酸化的SPAP2a Y3是D2C的特异性底物。(3)以SPAP2a.Y2为底物，D2C3M在一定的程度上实现了底物特异性的转变，催化活性较D2C强，介于D1C和D2C之间。(4)以SPAP2a Y3为底物，D1C4M在一定的程度上实现了底物特异性的转变，催化活性较D1C强，介于D1C和D2C之间。
　　 综上所述，本课题已顺利完成了对D1C/D2C单磷酸化特异性底物的确证，及对β5—loop—β6区域内3个有差异的氨基酸残基对于底物特异性影响的揭示。该研究成果为将来研究SHP—1/SHP—2催化活性域的底物特异性和催化机制，及日后选择特异性底物用于生成酶—底物复合晶体提供了理论依据；同时，也为进一步研究蛋白酪氨酸磷酸酶SHPs在细胞信号转导通路中的生物学作用及调控机制奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：常用英汉对译表

声明

第一章 文献综述

1.细胞信号转导概述

2.蛋白质可逆磷酸化调节的概述

3.蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶的研究进展

4.SHP-1和SHP-2的研究进展

5.ITIM与ITAM的的概述

6.课题的研究基础及目的意义

第二章 SHP-1/SHP-2催化活性域蛋白及其各突变体蛋白的表达纯化

1.试验材料

2.试验方法

3.试验结果

4.讨论

5.小结

第三章 以PY为底物对D1C和D2C及其突变体蛋白进行酶动力学特性分析

1.试验材料

2.试验方法

3.实验结果

4.讨论

5.小结

第四章 单磷酸化位点PZR Y5/Y6的表达及在底物特异性研究中的应用

1.试验材料

2.试验方法

3.试验结果

4.讨论

5.小结

第五章 单磷酸化位点SPAP2a Y1-Y4的表达及在底物特异性研究中的应用

1.实验材料

2.试验方法

3.试验结果

4.讨论

5.小结

结论

课题未来的研究方向

参考文献

附录

攻博期间学术论文的发表情况

致谢