鸡传染性支气管炎病毒广西分离株GX-YL5和GX-YL9的全基因组序列测定和生物信息学分析

摘要

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，该病由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起，是至今严重危害我国养禽业最重要的疫病之一，给养鸡生产带来巨大损失。
　　 为更加全面探讨IBV广西分离株的分子变异机制、致病机理和毒力进化特征，本研究采用基因组引物测序法对致病性强、与常用疫苗株血清型不同的代表性广西分离株GX-YL5和GX-YL9进行全基因组序列的测定。根据GenBank公布的IBV全基因组序列（SAIBK，H52和A2），使用相关软件进行引物设计及引用一部分已发表引物。测序结果表明分离株GX-YL5和GX-YL9的基因组全长分别为27720bp和27597bp，Genebank登录号分别为HQ848267.1和HQ850618.1。
　　 基因注释结果表明两分离株均符合冠状病毒IBV的基因组结构特征，为IBV经典的基因组结构：5'-UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。
　　 IBV广西分离株GX-YL5和GX-YL9的生物信息学分析包括全基因组核苷酸序列的插入与缺失分析、全基因组的同源性分析、全基因组序列系统发育树构建、结构蛋白基因系统发育树构建、重组预测及以分离株GX-YL5为模型的RNA茎环结构预测。
　　 全基因组序列的插入与缺失分析表明分离株GX-YL5和GX-YL9主要在基因组核苷酸3226-3561位、20429-20830位、21238-21378位、24064-24253位、24559-25579位、27193-27405位存在明显的碱基插入和缺失现象。全基因组同源性分析结果表明，IBV广西分离株GX-YL5和GX-YL9的全基因组核苷酸序列均与CQ04-1株的相似度最高，均为94.7％，说明两分离株与CQ04-1株最有可能具有同源性；而分离株GX-YL5和GX-YL9的全基因组核苷酸序列均与Georgia 1998 pass8株的相似度最低，均为84.3％，说明两分离株和Georgia 1998 pass8株亲缘关系可能最远。
　　 结构蛋白基因系统发育树构建结果表明，IBV广西分离株GX-YL5和GX-YL9的主要与毒株SC021202、SAIBK、CQ04-1、DY07和A2位于较近发育分支上，同时，IBV广西分离株GX-YL5和GX-YL9的结构蛋白基因系统发育分析结果一定程度上体现出与全基因序列水平的不一致性，这可能与IBV特殊转录机制导致的重组现象有关，也说明想要获得IBV全基因组层面的进化关系，全基因组序列的测定具有必要性。
　　 重组预测结果表明分离株GX-YL5和GX-YL9结构蛋白区段(S-3UTR)具有较多重组区域。分离株GX-YL5的S蛋白S2亚基段有一个约400bp的类CQ04-1和DY07重组片段，可能的重组位点位于其基因组核苷酸第22523位，另外M蛋白、N蛋白和3UTR区均有被预测的重组位点，分别位于基因组核苷酸第24741、26103和27223位。分离株GX-YL9在其基因组3a蛋白、M蛋白、5a蛋白和N蛋白处均有被预测的重组位点，分别为基因组第23805、24530、25702和26166位。
　　 本研究结合冠状病毒的不连续转录机制从分子结构层面对被预测发生于IBV分离株GX-YL5的重组现象进行了研究和解释。
　　 RNA茎环结构的预测结果表明，分离株GX-YL5基因组前导序列的茎环结构I与核苷酸相似率高的毒株比较，具有较多核苷酸突变位点，毒株间的重组有可能依赖于这一茎环结构的高突变性。而分离株GX-YL5中ORF1b与S蛋白融合区的一个疏水性氨基酸区域（信号肽区域）在冠状病毒中具有较高的保守性，RNA折叠预测为茎环结构，有可能是发生重组的关键部位。综合来说，IBV毒株间的重组有可能依赖于前导序列茎环结构I高突变效应和ORF 1b 融合区RNA茎环结构共同造成的宿主特异性稳定状态，从而造成在共感染情况下毒株间亚基因组mRNAs和其它形式的重组现象较为普遍。
　　 结合毒株分离地情况，暗示IBV毒株间的重组可能一定程度上由地理空间因素所引起，这一情况使得IBV特殊的不连续转录机制具有适宜于其发生的压力环境，从而造成了不同毒株间重组现象的发生。
　　 本研究获得了IBV广西分离株GX-YL5和GX-YL9的全基因组序列，并上传至Genebank，丰富了冠状病毒生物数据库信息，也为开展IBV反向遗传技术研究IBV分子生物学特性提供了依据，为新型疫苗和治疗性药物的研制与开发奠定基础；预测得到了分离株GX-YL5和GX-YL9可能的重组区域和位点，并结合IBV病毒的转录机制从分子结构层面进行了分析与解释，这将有助于从本质上了解IBV的致病机理和进化特征。本研究有重要科学价值和应用前景。