山药块茎发育生理生化变化及基因表达差异的研究

摘要

山药(Dioscorea opposita Thunb.)属薯蓣科(Dioseoreaceae.)薯蓣属(Dioscorea L.)，为一年生或多年生缠绕蔓性草质藤本植物，其地下形成肉质肥厚根状茎或块茎，是山药主要商品器官，它既可以食用也可以药用。山药块茎含有淀粉、蛋白质、糖类、维生素、尿囊素、皂苷、胆甾醇、多糖以及蛋白质的复合体-粘液质等物质，具有补脾健胃、补肺止咳、固肾、滋阴壮阳、益精、驻容延年、抗癌、防治糖尿病等功效。由于山药不开花或者花而不结实，给通过杂交育种技术进行品种遗传改良带来相当难度。同时，山药块茎深埋在土壤中，难以进行实时定位观察和测定。因此，对山药块茎生长发育机制还知之不多。本研究采用山药定向栽培技术，对山药块茎发育过程中物质积累及其相关酶活性变化、基因差异表达等进行研究。主要结果如下：
　　 1、广西山药种质资源遗传多样性
　　 对收集到12份广西山药种质进行种植和生物学性状观察。结果表明，广西山药种质资源多态性丰富，15个形态指标各具多样性；应用形态标记方法，将它们分成普通山药和田薯两个类群(欧氏距离为14-25间)；结合形态标记与生态学特征，又可将它们分成四个类群(欧氏距离为12-14间)：北方山药、南方山药、野生山药、田薯。本文参试材料桂淮5和桂淮16分属普通山药、田薯，具有代表性。
　　 2、初步揭示山药块茎形态发育规律
　　 通过实时观测，发现山药块茎各种形态与块茎发育显著相关，它们随着块茎发育时间变化而表现出一定的节奏性，每个形态指标发育总体均呈“S”型发育规律，并且各个指标发育是同步的。t检验表明，采收后不同品种间的茎宽、茎重、茎体积等指标差异极显著，茎长差异不显著，说明不同形态指标遗传改良潜力不同，以体积大小改良潜力最大，块茎长度最小。但品种间有差别，大型品种以改良茎长来提高茎重比茎宽更为显著，相反小型品种以茎粗更有效。
　　 3、不同品种山药块茎采收期代谢物质含量及其相关性
　　 采用多变量统计方法，比较3份山药材料(桂淮2、桂淮5、桂淮16)采收期块茎中14个代谢产物含量及其相关性。结果表明，桂淮16的水分、可溶性糖、蔗糖、苹果酸、酒石酸、皂苷及可滴定酸的含量显著高于桂淮2、5，还原糖、可溶性蛋白质含量显著低于桂淮2、5。苹果酸、酒石酸、可滴定酸等酸类物质之间显著相关，其它物质之间相关性在品种间有差异。3品种中14个代谢产物可由4个公因子分别反映98.15%、93.11%、94.03%信息量，酸类物质是各品种第1公因子，其余公因子在品种间影响力不一致。由此表明，不同品种山药代谢产物的含量、相关性、关键因子有差异，从而形成不同品质效应，酸类物质在山药块茎采收期物质代谢和品质形成中起关键作用。
　　 4、山药块茎物质积累及相关酶活性变化对块茎发育影响
　　 随着山药块茎发育进程的推进，块茎长度及干物质积累持续增加，淀粉酶(AMY)活性降低；多数碳水化合物、功能性物质及过氧化物酶(POD)、酸性转化酶(AI)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性先持续增加，达到峰值后下降，但峰期不同；2个品种的还原糖、ADPG焦磷酸化酶(AGPase)变化不一致。t检验表明，在块茎发育全过程中，品种间的干物质、淀粉、皂苷差异显著。可溶性糖、AGPase、还原糖与蔗糖显著相关；多糖、Vc、皂苷与淀粉显著相关；干物质、AMY、AGPase、蛋白质与块茎伸长膨大显著相关。由此表明，蔗糖积累、SPS和AI活性在山药块茎发育中起关键调控作用，主要功能性物质彼此间密切相关。
　　 5、块茎发育过程中山药叶片碳水化合物代谢变化
　　 可溶性糖积累及蔗糖酸性转化酶活性变化在叶片碳水化合物代谢中起主导作用，多数碳水化合物代谢在块茎发育前期持续增加，中期达到高峰后下降。干物质、还原糖、ADPG焦磷酸化酶、蛋白质与块茎长度显著相关。桂淮5过氧化物酶活性全程均值显著高于桂淮16，以及块茎发育中期至后期，桂淮5蔗糖磷酸合成酶、转化酶、淀粉酶等分别比桂淮16高1.52倍、1.45倍和2.33倍，而AGPase低1.7倍，说明桂淮5比桂淮16“源”强。进入枯叶期，桂淮5叶片中蔗糖、可溶性糖、淀粉继续下降，而桂淮16不降反升，且桂淮5碳水化合物积累峰值与后期最小值差值比桂淮16大，表明说明桂淮5比桂淮16“源流”大。可见，说明山药叶“源”碳水化物代谢规律与块茎“库”发育进程是协调一致的关系，品种间叶片碳水化物代谢差异影响到块茎发育进程。
　　 6、成功构建山药块茎不同发育阶段SSH文库
　　 利用抑制消减杂交技术(SSH)成功构建了山药块茎发育前期和中期cDNA的抑制消减文库，文库质量能够满足下一步实验的要求。正向消减文库包括1500个cDNA克隆，反向消减文库包括1000个cDNA克隆，cDNA片段的长度分布在200-800bp左右，平均长度约500bP左右，消减杂交可将18S rRNA对照基因减弱了215倍以上。
　　 7、获得山药块茎不同发育阶段基因差异表达谱
　　 通过对cDNA文库生物信息学分析，获得山药块茎发育前期与中期基因差异表达谱(基因表达种类和丰度信息)。
　　 随机挑取获得107个唯一序列，分为9大类，包括细胞防御基因(22个，占20.6%)、未知功能基因(6个，占5.6%，包括推测基因)、光呼吸作用(1个，占0.9%)、生物合成(5个，占4.7%)、细胞组织结构(15个，占14.0%)、生物学径途(12个，占11.2%)、分子功能(12个，占11.2%)、信号传导(5个，占4.7%)、发育调控(29个，占27.1%)。差异表达基因主要定位于细胞核、叶绿体和细胞质，前期文库主要定位于叶绿体，中期文库主要定位于细胞核；表达差异基因中，有5个克隆有信号肽蛋白，2个克隆有信号锚定蛋白。
　　 8、挖掘到与山药块茎发育、功能性物质及植物细胞防御等功能相关的基因
　　 通过Blast同源性比对、SBASE功能结构域预测、WoLF PSORT亚细胞定位和SignalP信号肽分析等生物信息学分析，结果表明：(1)锌指蛋白、泛素-连接酶体、碳酸酐酶、EGF-like、NDPK蛋白、氨基酸通透酶、钙调素结合蛋白、纤维素合酶等基因在山药块茎发育中期上调，BTB蛋白等基因在山药块茎发育中期下调，它们多与植物块茎发育相关，但参与植物生长物质代谢相关基因出现频率较高。(2)山药块茎发育过程中，涉及到大量与物质合成代谢相关基因差异表达，尤其与次生代谢物质合成和运输基因更为显著，包括：ABC转运蛋白、糖基转移酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶等在山药块茎发育中期上调，α-淀粉酶等在山药块茎发育中期下调。(3)在山药发育进程中，伴随着大量与植物细胞防御有关基因的差异表达，共同参与植物抗逆境反应，包括酪蛋白激酶、EPSP合成酶、锌指蛋白等在山药块茎发育中期上调，植物蛋白酶抑制剂等在山药块茎发育前期上调。

目录

文摘

英文文摘

缩写词

第一章 前言

1 山药概述

1.1 山药资源

1.2 山药成分和利用研究

2 块茎发育生理生化基础研究

2.1 块茎的形态建成及发育规律

2.2 块茎发育过程中物质积累变化

2.3“源-库”关系

2.4 品种遗传特性与块茎发育

2.5 产地特性与块茎发育

3 块茎发育分子生物学研究

4 SSH技术

5 研究目的和主要内容

6 研究技术路线

第二章 广西山药种质资源遗传多样性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 山药的主要农艺性状

2.2 聚类分析

2.3 综合分类分析

3 讨论

4 小结

第三章 发育过程中山药块茎形态变化

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 田间试验设计

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 块茎发育时期划分

2.2 不同品种山药块茎形态差异

2.3 形态指标相关性分析

3 讨论

3.1 山药块茎形态发育规律

3.2 山药块茎形态相关性

4 小结

第四章 山药块茎代谢物质含量及其相关性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 代谢产物测定方法

1.3 数据统计方法

2 结果与分析

2.1 山药块茎代谢物质含量差异性

2.2 山药代谢物质含量相关分析

2.3 山药块茎代谢物质因子分析

3 讨论

4 小结

第五章 山药块茎发育进程中块茎生理生化变化

第六章 山药块茎发育过程中叶片碳水化合物代谢变化

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 块茎发育膨大时期叶片干物质变化

2.2 块茎膨大过程中叶片蛋白质变化

2.3 块茎膨大过程中叶片碳水化合物变化

2.4 块茎生长膨大进程中叶片碳水化合物代谢相关酶活性变化

3 讨论

3.1 不同品种山药叶片碳水化合代谢及其酶活性变化的差异

3.2 山药叶片与块茎之间的“源-库”关系

4 小结

第七章 山药块茎不同发育阶段抑制消减文库构建

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 菌株和载体

1.3 总RNA提取

1.4 cDNA的合成

1.5 Rsa 1酶进行酶切cDNA

1.6 cDNA连接接头

1.7 第一次消减杂交反应

1.8 第二次消减杂交反应

1.9 第一次抑制PCR扩增

1.10 第二次抑制PCR扩增

1.11 差减效率的检测

1.12 文库构建

1.13 斑点杂交检测克隆

2 结果与分析

2.1 RNA的分离纯化

2.2 cDNA合成及RsaI酶切

2.3 消减效率的检测

2.4 消减文库中cDNA片段大小的PCR检测

2.5 斑点杂交检测结果

3 讨论

3.1 不同检测方法对SSH文库质量的影响

3.2 不同的RNA提取方法对文库质量的影响

4 小结

第八章 山药块茎发育相关EST序列生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 EST序列分析流程

1.2 EST序列测序

1.3 序列前处理

1.4 聚类和拼接

1.5 EST数据注释

1.6 蛋白质功能的分类

1.7 蛋白质结构功能域的分析

1.8 信号肽预测

1.9 蛋白亚细胞定位

2 结果与分析

2.1 序列组装

2.2 差异表达基因序列同源性分析

2.3 蛋白质功能的分类

2.4 蛋白质亚细胞定位

2.5 信号肽分析

2.6 山药不同发育阶段差异表达基因分析

3 讨论

3.1 山药块茎不同发育阶段差异表达基因特性

3.2 山药块茎发育差异表达基因蛋白信号肽预测

3.3 山药块茎发育差异表达基因蛋白质结构域

3.4 EST分析的重要性

3.5 块茎发育进程中与生长发育及调控相关基因的差异表达

3.6 块茎发育进程中存在着植物次生代谢物相关基因差异表达

3.7 山药块茎发育进程中存在植物细胞防御相关基因差异表达

4 小结

4.1 成功获得了山药差异不同发育阶段基因差异表达谱

4.2 挖掘出与山药块茎发育、物质合成和细胞防御相关基因

第九章 全文讨论与总结

1 全文讨论

1.1 形态标记对山药种质资源遗传多样性分析作用

1.2 山药块茎形态发育规律

1.3 山药块茎发育过程中物质代谢及相关酶活性变化与块茎发育关系

1.4 山药块茎不同发育阶段基因差异表达与块茎发育关系

2 全文总结

2.1 广西山药具有遗传多样性

2.2 山药块茎呈现“S”型发育规律

2.3 不同品种山药块茎采收期代谢物质的含量及其相关性不同

2.4 山药块茎发育过程中物质积累及相关酶活性变化

2.5 叶片物质代谢及源-库协调

2.6 成功构建山药块茎不同发育阶段SSH文库

2.7 获得山药块茎不同发育阶段基因差异表达谱

2.8 挖掘到与山药块茎发育相关基因

2.9 发现山药块茎发育进程中存在着植物次生代谢物相关基因差异表达

2.10 发现块茎发育进程中存在植物细胞防御相关基因差异表达

3 创新之处

4 问题与展望

致谢

参考文献

附录：