蜡样芽孢杆菌GXBC-3三个普鲁兰酶基因的克隆表达、酶学性质研究及分子改造

摘要

探索获得新型优良的普鲁兰酶基因，丰富普鲁兰酶研究理论，对实现普鲁兰酶的国产化具有深远意义。以开发工业用普鲁兰酶的为目的，采集不同土壤样品混合堆肥，利用平板分离法从中筛选、分离得到一株产普鲁兰酶菌株。经过形态学特征和生理生化特征观察，并结合其16SrDNA系统发育分析鉴定其为蜡样芽孢杆菌属，命名为Bacillus cereus GXBC-3。通过分析GenBank数据库中蜡样芽胞杆菌假定Ⅰ型、Ⅱ型普鲁兰酶基因序列，从Bacillus cereus GXBC-3中克隆得到三个普鲁兰酶基因pulA、pulB和pulC，并分别导入大肠杆菌Escherichia colii XL10-Gold得到高效诱导表达。通过镍柱亲和层析获得纯化重组酶PulA、PulB和PulC，其蛋白表达量和相对分子质量分别为4.23 mg/mL、84.56 kDa，6.43 mg/mL、94.71 kDa和3.33 mg/mL、95.37 kDa。
　　 酶学性质研究表明重组酶PulA能水解α-1，6-和α-1，4-糖苷键，为Ⅱ型普鲁兰酶，以普鲁兰糖为底物时，最适反应温度及pH分别为40℃和6.5，其比活力、Km和Vmax分别为32.89 U/mg、0.33 mg/mL和40.65μmol/minmg；以可溶性淀粉为底物时，最适反应温度及pH分别为50℃和7.0，其比活力、Km和Vmax分别为25.71 U/mg、2.63 mg/mL和92.59μmol/minmg。重组酶PulB和PulC二者均只能水解α-1，6-糖苷键，为Ⅰ型普鲁兰酶，以普鲁兰糖为底物时，重组酶PulB的最适反应温度及pH分别为45℃、7.0，其比活力、Km和Vmax分别为228.54 U/mg、1.17 mg/mL和434.78μmol/minmg；而重组酶PulC的最适反应温度及pH分别为45℃、6.5，其比活力、Km和Vmax分别为229.65 U/mg、1.96 mg/mL和400.00μmol/minmg。
　　 利用反向PCR对重组酶PulA、PulB和PulC进行初步分子改造，得到5个缺失子，其中缺失酶QSPulA和QSPulB不表达；而缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3小量表达，其纯化酶学性质研究结果表明：(1)缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3除具普鲁兰酶活性还具有低活力的淀粉酶活，表明N端结构域Pfm PUD的缺失或不完整能将Ⅰ型普鲁兰酶转化为Ⅱ型普鲁兰酶。(2)缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3的表达量均严重下降，由3.33 mg/mL的表达量降至不足1 mg/mL，表明N端结构域Pfm PUD的缺失或不完整能显著降低酶的表达量。(3)缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3的普鲁兰酶的比活、Km和Vmax均显著降低，表明N端结构域Pfm PUD的缺失或不完整能显著降低酶的普鲁兰酶活性。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 普鲁兰酶

1.1.1 概述

1.1.2 普鲁兰酶的定义与分类

1.1.3 普鲁兰酶菌种的来源

1.2 普鲁兰酶研究技术发展

1.2.1 概述

1.2.2 传统微生物改造技术

1.2.3 基因工程改造技术

1.2.4 基因酶的克隆表达

1.3 普鲁兰酶的分子结构与催化机制

1.3.1 普鲁兰酶的分子结构

1.3.2 普鲁兰酶的催化机制

1.4 普鲁兰酶的应用

1.5 研究的目的和意义

1.6 技术路线

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品采集

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 主要酶和试剂

2.1.4 培养基及主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 产普鲁兰酶菌株的筛选

2.2.3 基因组DNA的提取

2.2.4 质粒的制备

2.2.5 感受态细胞的制备

2.2.6 PCR产物的纯化

2.2.7 DNA的酶切与胶回收

2.2.8 DNA的连接

2.2.9 连接产物的转化

2.2.10 TA克隆重组子的筛选

2.2.11 普鲁兰酶基因的克隆与测序

2.2.12 信号肽和疏水跨膜区预测

2.2.13 普鲁兰酶基因的表达

2.2.14 重组普鲁兰酶的纯化

2.2.15 SDS-PAGE凝胶电泳

2.2.16 蛋白浓度测定

2.2.17 重组普鲁兰酶酶学性质研究

2.2.18 酶活力测定

2.2.19 葡萄糖标准曲线的绘制

2.2.20 重组普鲁兰酶的分子改造

2.2.21 HPLC对普鲁兰酶水解产物的分析

第三章 结果与分析

3.1 产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定

3.1.1 GXBC-3的分离筛选

3.1.2 GXBC-3的形态学及生理生化特征

3.1.3 GXBC-3的16S rDNA系统发育分析

3.2 蛋白标准曲线和葡萄糖标准曲线的绘制

3.3.1 蛋白标准曲线的绘制

3.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制

3.3 GXBC-3普鲁兰酶pulA基因的的克隆表达、纯化及酶学特性

3.3.1 普鲁兰酶基因pulA的TA克隆与测序

3.3.2 普鲁兰酶基因pulA序列分析

3.3.3 pSE380-pulA重组表达质粒的构建、筛选

3.3.4 普鲁兰酶PulA的表达纯化

3.3.5 重组酶PulA的酶学特性

3.4 GXBC-3普鲁兰酶pulB基因的的克隆表达、纯化及酶学特性

3.4.1 普鲁兰酶基因pulB的TA克隆与测序

3.4.2 普鲁兰酶基因pulB序列分析

3.4.3 pSE380-pulB重组表达质粒的构建、筛选

3.4.4 普鲁兰酶PulB的表达纯化

3.4.5 重组酶PulB的酶学特性

3.5 GXBC-3普鲁兰酶pulC基因的的克隆表达、纯化及酶学特性

3.5.1 普鲁兰酶基因pulC的TA克隆与测序

3.5.2 普鲁兰酶基因pulC序列分析

3.5.3 pSE380-pulC重组表达质粒的构建、筛选

3.5.4 普鲁兰酶PulC的表达纯化

3.5.5 重组酶PulC的酶学特性

3.6 反向PCR介导普鲁兰酶PulA的分子改造

3.6.1 pSE380-QSpulA重组表达质粒的构建与筛选

3.6.2 缺失酶QSPulA的表达纯化

3.7 反向PCR介导普鲁兰酶PulB的分子改造

3.7.1 pSE380-QSpulB重组表达质粒的构建与筛选

3.7.2 缺失酶QSPulB的表达纯化

3.8 反向PCR介导普鲁兰酶PulC的分子改造

3.8.1 pSE380-QSpulC重组表达质粒的构建与筛选

3.8.2 缺失酶QSPulC的表达纯化

3.8.3 缺失酶QSPulC的酶学特性

第四章 讨论

4.1 产普鲁兰酶菌株Bacillus cereus GXBC-3的筛选鉴定

4.2 Bacillus cereus GXBC-3普鲁兰酶的表达和酶学特性

4.3 普鲁兰酶的分子改造

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 问题与展望

参考文献

附录1

附录2

致谢

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