地衣芽孢杆菌GXT-1两个碱性蛋白酶基因的克隆表达、酶学性质研究及分子改造

摘要

碱性蛋白酶作为一种工业上非常重要的酶类，占据全球酶市场的30％，获得新型优良的碱性蛋白酶基因，深化碱性蛋白酶的研究理论，对碱性蛋白酶的开发和应用具有重要的意义。
　　 本研究从自然界筛选到一株产耐碱性蛋白酶的野生菌株，初步鉴定为地衣芽孢菌属，命名为Bacillus licheniformis GXT-1。并成功地从该菌株的基因组DNA中克隆到二个碱性蛋白酶基因bl1、bl2，在大肠杆菌成功表达并通过镍柱亲和层析获得纯化重组酶BL1、BL2，其中BL1成熟的酶蛋白分子量大小为33KD，BL2成熟的酶蛋白分子量大小为27KD。
　　 酶学性质研究表明BL1、BL2都属于蛋白酶S8家族。以酪蛋白为底物时，BL1的最适反应pH为10.0，在pH7.0-pH11.0有80％以上的相对活力，最适反应温度温度为70℃，比活为14643U/mg，Km值为3.80mg/mL，最大反应速度Vmax为19803 U/mg。BL2的最适反应pH为10.0，在pH8.0-pH11有80％以上的相对活力，最适反应温度温度为70℃，比活为21855 U/mg，Km值为13.59 mg/mL，最大反应速度Vmax为48278 U/mg。
　　 利用反向PCR对重组酶BL1、BL2进行初步分子改造，得到7个突变子M94S、M248S、M255S、M284S以及M118A、M134S、M221S，其中突变子M94S和M134S酶活缺失，M248S、M255S、M118A、M221S的Km值有所降低，但只有M248S突变子比活提高，其他突变子的比活都有所降低。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 蛋白酶的概述及分类

1．2 碱性蛋白酶蛋白酶

1．2．1 碱性蛋白酶蛋白酶的来源

1．2．2 碱性蛋白质结构特点及活性中心

1．2．3 碱性蛋白酶的空间结构和反应机理

1．2．4 碱性蛋白酶的性质

1．3 碱性蛋白酶的应用

1．4 碱性蛋白酶的分子改造研究概况

1．4．1 酶的分子改造

1．4．2 酶分子改造策略

1．4．3 碱性蛋白酶的分子改造

1．5 研究背景和意义

1．6 技术路线

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 土样的采集

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 主要酶和试剂

2．1．4 主要仪器和设备

2．1．5 培养基

2．2 方法与步骤

2．2．1 产碱性蛋白酶菌株的筛选

2．2．2 筛选菌株总DNA的提取及制备

2．2．3 菌株的16SrDNA鉴定

2．2．4 感受态细胞的制备

2．2．5 质粒的提取

2．2．6 DNA的酶切和连接

2．2．7 DNA连接产物的转化

2．2．8 碱性蛋白酶的基因克隆

2．2．9 重组质粒的验证

2．2．10 蛋白酶的诱导表达

2．2．11 蛋白酶的纯化

2．2．12 蛋白质SDS-PAGE电泳

2．2．13 蛋白含量的测定

2．2．14 酪氨酸标准曲线的绘制

2．2．15 蛋白酶酶活力的测定

2．2．16 碱性蛋白酶酶学性质的研究

2．2．17 碱性蛋白酶BL1、BL2的分子改造

第三章 结果与分析

3．1 产碱性蛋白酶菌株的筛选

3．2 GXT-1总DNA的制备

3．3 GXT-1菌株16SrDNA的鉴定

3．4 碱性蛋白酶BL1的克隆表达及酶学性质

3．4．1 碱性蛋白酶BL1的信号肽预测

3．5．2 碱性蛋白酶基因bl1的克隆

3．5．3 pET22b(+)-bl1重组质粒的构建

3．5．4 pET22b(+)-bl1重组质粒的验证

3．5．5 碱性蛋白酶BL1的表达及纯化

3．5．6 碱性蛋白酶BL1的酶学性质

3．6 碱性蛋白酶BL2的克隆表达及酶学性质

3．6．1 碱性蛋白酶BL2的信号肽预测

3．6．2 碱性蛋白酶bl2基因的克隆

3．6．3 pET22b(+)-bl2重组质粒的构建

3．6．4 pET22b(+)-bl2重组质粒的验证

3．6．5 BL2碱性蛋白酶的表达及纯化

3．6．6 碱性蛋白酶BL2的酶学性质

3．7 碱性蛋白酶基因bl1、bl2的分子改造

3．7．1 碱性蛋白酶BL1同源建模及突变点的选择

3．7．2 bl1反向PCR

3．7．3 BL2突变酶的纯化及SDS-PAGE分析

3．7．4 BL1野生型和突变型酶的比活力测定

3．7．5 碱性蛋白酶BL2同源建模及突变点的选择

3．7．6 bl2反向PCR

3．7．7 BL2突变酶的纯化及SDS-PAGE分析

3．7．8 BL2野生型和突变型酶的比活力测定

第四章 讨论

4．1 产碱性蛋白酶菌株Bacillus licheniformis GXT-1的筛选鉴定

4．2 Bacillus licheniformis GXT-1碱性蛋白酶的克隆表达和酶学性质

4．3 碱性蛋白酶的分子改造

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 问题与展望

参考文献

附录1

附录2

附录3

致谢

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