巨大芽孢杆菌B196菌株产抗菌物质的发酵条件优化及分离鉴定研究

摘要

本研究优化了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)B196菌株产生拮抗物质的发酵条件，对该菌产生的拮抗物质进行分离纯化和鉴定，并对其特性和抑菌活性进行研究。所获得的结果如下：
　　 ⑴通过单因素试验筛选出培养B196菌株高产抗菌物质的最佳碳源、氮源和无机盐分别为蔗糖、蛋白胨和氯化钠，通过正交试验获得B196菌株发酵的培养基配方为蔗糖10g/L，蛋白胨20g/L，NaCl7g/L，K2HPO45g/L;最佳条件为:温度27℃，时间5d，接种量1％，pH7.0，装液量40 mL/200 mL。
　　 ⑵从B196菌株的代谢产物中分离纯化获得的化合物，双缩脲反应表现为阳性，茚三酮反应开始表现为阴性，但经过水解后表现为阳性;该化合物含有Asx、Glx、Pro、Ser和Tyr等5个氨基酸，它们的摩尔比约为3∶1∶1∶1∶1;该化合物的分子量为1042.5927Da;利用碰撞诱导解离(CID)技术所获知其离子碎片与IturinA家族中Iturin A2吻合，故将该化合物鉴定为IturinA2。
　　 ⑶以水稻纹枯病菌为指示菌，测定从B196菌株的代谢产物中分离纯化获得的化合物的稳定性。结果表明，该化合物在90℃处理60 min和121℃高温高压处理20 min后抑菌活性分别下降了40.45％和60.45％;该化合物经不同的pH处理24 h，在pH2-10时抑菌活性没有发生变化，但在pH为12时活性下降;该化合物对胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶不敏感。采用菌丝生长速率法，测定了化合物对7种植物病原真菌的活性，结果表明，其对7种供试植物病原真菌均有活性，其中对水稻稻瘟病菌（Pyricularia grisea）的活性最强;采用抑菌圈法测定化合物对植物病原细菌的活性，发现其对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌（X.oryzae pv.Oryzae）和番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）等5种植物病原细菌有抑菌活性，但是对大豆细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv.Glycinea）、番茄细菌性斑点病菌（P.syringae pv. Tomato）和魔芋软腐病菌(Pectobacterium carotovora subsp.crotovora)无抑菌活性。
　　 ⑷B196菌株产生的纯拮抗物质浓度为40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL时，对水稻纹枯病的防效分别为84.01％、97.47％、100％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 水稻纹枯病的防治

1．1．1 农业措施

1．1．2 抗病品种

1．1．3 化学农药

1．1．4 生物防治

1．2 防治水稻纹枯病的芽孢杆菌

1．3 芽孢杆菌产生脂肽类抗菌物质的种类

1．3．1 表面活性素

1．3．2 伊枯草菌素

1．3．3 丰原素

1．4 脂肽类化合物的结构鉴定

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 主要仪器和试剂

2．1．4 软件

2．2 巨大芽孢杆菌B196发酵条件的优化

2．2．1 B196菌株种子液的制备

2．2．2 B196菌株发酵滤液的活性测定

2．2．3 培养基配方的优化

2．2．4 发酵条件的优化

2．3 B196菌株抑菌物质的分离纯化及鉴定

2．3．1 B196菌株的培养

2．3．2 拮抗物质抑菌活性的测定方法

2．3．3 拮抗物质的分离纯化

2．3．4 鉴定纯拮抗物质

2．4 纯拮抗物质的稳定性

2．4．1 热稳定性

2．4．2 蛋白酶的稳定性

2．4．3 pH稳定性

2．5 纯化合物的活性

2．5．1 纯拮抗物质对植物病原真菌的活性

2．5．2 纯拮抗物质对植物病原细菌的活性

2．6 纯拮抗物质对水稻纹枯病的离体防治试验

3 结果与分析

3．1 巨大芽孢杆菌B196菌株发酵条件的优化

3．1．1 培养基配方优化的结果

3．1．2 发酵条件优化的结果

3．2 B196菌株抑菌物质的分离纯化及鉴定

3．2．1 粗提物对水稻纹枯病菌的活性

3．2．2 纯化巨大芽孢杆菌B196菌株产生的拮抗物质

3．2．3 纯拮抗物质的鉴定

3．3 纯拮抗物质的稳定性

3．3．1 热稳定性

3．3．2 酶稳定性

3．3．3 pH稳定性

3．4 纯拮抗物质的抑菌活性测定

3．4．1 纯拮抗物质对植物病原真菌的活性

3．4．2 纯拮抗物质对植物病原细菌的活性

3．5 离体防治试验

4 讨论与结论

4．1 结论

4．1．1 B196菌株发酵培养基的优化和发酵条件的优化

4．1．2 B196菌株抑菌物质的分离纯化和鉴定

4．1．3 B196菌株抑菌物质的稳定性

4．1．4 纯拮抗物质的抑菌活性

4．2 讨论

4．2．1 B196菌株发酵培养基的优化和发酵条件的优化

4．2．2 B196菌株抑菌物质的分离纯化和鉴定

4．2．3 B196菌株抑菌物质的稳定性及抑菌活性

4．2．4 Iturin A2对植物病原菌防治作用

4．3 本研究的创新点

4．4 后续研究设想

致谢

参考文献

附录A

附录B