Paenibacillus cookii GX-4的β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达、酶学性质研究与分子改造

摘要

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纤维二糖中的β-1，4-糖苷键，其作用直接影响纤维素的降解效率。β-葡萄糖苷酶被应用于酒类、茶类、饮料等工业上，取得了巨大的经济效益。近年来β-葡萄糖苷酶逐步的应用于生产白藜芦醇和大豆异黄酮方面。
　　 本研究构建了本实验室自行筛选到的P.cookii GX-4的fosmid基因组文库，文库约有6000个克隆子。利用筛选平板从文库中成功的筛选获得4个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆，对其中2个克隆子进行亚克隆，发现都含有一个相同的2.3 kb的ORF，对该ORF进行蛋白质结构组件分析，表明该ORF编码的蛋白质为GH3的β-葡萄糖苷酶，将这个基因命名为Pbgl。利用PCR方法扩增Pbgl克隆到表达载体pSE380上，实现了Pbgl基因在大肠杆菌中表达，通过镍亲和层析对Pbgl进行蛋白纯化，并进行了深入的酶学性质研究。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明Pbgl是以单体形式存在，目的蛋白质大小约为84kDa。以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)作为底物，Pbgl的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0，Km与Vmax值分别为0.1754±0.0194 mM和149±3.4 U/mg，葡萄糖抑制常数IC50值和Ki值分别为177.1mM和34.65 mM。Pbgl能够水解纤维二糖、乳糖、苦杏仁苷、染料木苷和黄豆苷。本实验还对Pbgl中与葡萄糖耐受性相关的氨基酸进行了易错PCR和定点突变研究，共获得六个正向突变体，分别为Rpbgl、W60L、W386A、W386C、W386F、W386L。对这六个突变体进行了酶学性质研究，发现与野生重组酶Pbgl相比，除Rpbgl之外其余五个突变体的酶活都存在不同程度的降低。并且W386A、W386C、W386F、W386L这四个突变体的最适温度由50℃降至40℃。在对突变酶的葡萄糖耐受性研究时，发现这六个突变体与野生酶相比均有一定程度的提高，其中W386C的葡萄糖耐受性最高，比野生酶提高了11.88倍。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 空气污染与能源危机

1．2 纤维素与纤维素酶的简介

1．3 β-葡萄糖苷酶的简介

1．4 β-葡萄糖苷酶的研究

1．5 β-葡萄糖苷酶的分子催化以及合成反应机制

1．6 β-葡萄糖苷酶的应用

1．6．1 β-葡萄糖苷酶在食品上的应用

1．6．2 β-葡萄糖苷酶在大豆异黄酮制备中的应用

1．6．3 β-葡萄糖苷酶在制造白藜芦醇的应用

1．7 基因组文库的构建

1．8 β-葡萄糖苷酶的反馈抑制

1．9 酶的分子改造

1．9．1 酶的定向进化

1．9．2 酶的定点突变

1．9．3 酶分子改造的应用

1．10 本论文研究的意义以及工作

1．11 技术路线

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株以及质粒

2．1．2 酶与主要使用试剂

2．1．3 培养基与溶液的配制

2．2 方法与步骤

2．2．1 P．cookii GX-4的培养

2．2．2 P．cookii GX-4的基因组DNA的提取

2．2．3 基因组文库的构建

2．2．4 P．cookii GX-4基因组文库的筛选

2．2．5 碱裂解法提取质粒法

2．2．6 感受态细胞制备与转化

2．2．7 重组fosmid的亚克隆及序列分析

2．2．8 含β-葡萄糖苷酶基因的亚克隆序列分析

2．2．9 β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的克隆

2．2．10 PCR产物与表达载体的酶切

2．2．11 PCR产物与载体的连接

2．2．12 连接产物的转化以及酶切验证

2．2．13 重组菌株的诱导表达

2．2．14 重组酶的纯化

2．2．15 纯化蛋白的SDS-PAGE及酶谱分析

2．2．16 蛋白质标准曲线的绘制及蛋白质定量分析

2．2．17 β-葡萄糖苷酶的酶学性质的测定

2．2．18 Pbgl的分子改造

第三章 结果与分析

3．1 P．cookii GX-4的fosmid基因组文库的构建

3．2 基因组文库的质量评估

3．3 含β-葡萄糖苷酶基因克隆的筛选

3．4 重组fosmid的亚克隆

3．5 P．cookii GX-4 β-葡萄糖苷酶基因的序列分析

3．6 β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的PCR扩增

3．7 重组质粒pSE-Pbgl的构建

3．7．1 pSE-Pbgl重组质粒的构建

3．7．2 pSE-Pbgl重组质粒的验证

3．8 镍亲和层析纯化蛋白的SDS-PAGE和酶谱分析

3．9 标准曲线的绘制

3．9．1 蛋白质标准曲线的绘制

3．9．2 pNP标准曲线的绘制

3．10 纯化重组酶pSE-Pbgl的酶学性质的研究

3．10．1 Pbgl的最适温度的测定

3．10．2 Pbgl的最适pH的测定

3．10．3 Pbgl的Km和Vmax值的测定

3．10．4 Pbgl的热稳定性的分析

3．10．5 Pbgl的pH稳定性的测定

3．10．6 金属离子对Pbgl酶活力的影响的测定

3．10．7 化学试剂对Pbgl酶活力的影响的测定

3．10．8 EDTA对Pbgl酶活力的影响的测定

3．10．9 糖对Pbgl酶活力的影响的测定

3．10．10 Pbgl的底物特异性的测定

3．10．11 Pbgl的水解产物分析

3．10．12 Pbgl对葡萄糖的耐受性研究

3．11 β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的分子改造

3．11．1 β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的随机突变

3．11．2 β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的定点突变

3．11．3 定点突变体的获得

3．11．4 突变体序列分析

3．11．5 突变体的SDS-PAGE分析

3．11．6 野生酶与突变体的酶学性质比较分析

第四章 讨论

4．1 fosmid文库的构建以及文库的筛选效率

4．2 Pbgl是一个碱性β-葡萄糖苷酶

4．3 Pbgl的底物特异性

4．4 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性研究

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 问题与展望

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与专利