狂犬病病毒受体NCAM、P75和nAchR的原核表达、多克隆抗体的制备以及病毒感染对细胞受体的影响

摘要

狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)是弹状病毒科狂犬病毒属的成员,具有高度的嗜神经性并且能引起致命的脑炎。目前没有有效的治疗方法,病死率几乎100％。狂犬病病毒编码五种蛋白,其中 G蛋白在决定病毒的宿主范围、嗜神经毒力、病毒的免疫原性及与宿主细胞表面受体分子的相互作用等方面起着重要的作用。病毒的细胞受体是病毒侵入靶细胞的门户,能与病毒特异性的结合,介导病毒入侵易感宿主细胞而启动其复制过程。RV在侵入神经肌肉接头时,位于突触后膜的nAchR和位于突触前膜的NCAM起到重要的介导作用。神经营养素受体P75同样作为狂犬病病毒的一个受体,当病毒进入神经元细胞后,P75可与狂犬病病毒 G蛋白结合从而使病毒进入细胞浆内进行逆向传递。
　　本课题从感染Flury毒株1 h的NA细胞中抽提总RNA,从总RNA中合成并克隆了NCAM、P75和nAchR基因,将这些基因片段插入原核表达载体pET-32a(+)克隆位点,并成功构建了pET-NCAM-711、pET-P75-513和pET-nAchR-525的重组原核表达质粒。将这些原核重组表达质粒分别转入原核表达宿主菌BL21(DE3)中,分别经过IPTG诱导而表达NCAM-711、P75-513和nAchR-525三种重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析发现,表达的三种重组蛋白 NCAM-711、P75-513和nAchR-525分别表达出52、45和47 KD的融合蛋白,同时证实,NCAM-711和nAchR-525主要以包涵体的形式表达,而P75-513则主要以可溶性蛋白的形式表达。分别经过Ni-NTA树脂纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原与弗氏佐剂乳化免疫小鼠,制备NCAM、P75和nAchR多克隆抗体。
　　由于自然状态下这三个受体在细胞表面的表达量很低,常规方法 IFA和WB等的反应很弱,难以达到检测标准,因此分别构建了三个受体的真核表达质粒 NCAM-1818-3.0、P75-1284-myc和nAchR-1509-myc。转染BHK-21细胞,获得过表达NCAM、P75和nAchR三个蛋白的BHK-21细胞。
　　分别以正常的NA细胞以及真核表达质粒转染BHK-21细胞24 h后收集的细胞和细胞蛋白为样品,用IFA和Western-blot方法检测细胞表面的受体蛋白与抗体的反应性。IFA结果表明,制备的NCAM、P75和nAchR多克隆抗体分别与NA细胞上的三种受体结合都显示特异性荧光。Western-blot结果表明,制备的抗NCAM和P75蛋白的两种多克隆抗体可与相应的细胞转染受体蛋白NCAM和P75反应,而nAchR多克隆抗体可与NA细胞及转染BHK-21细胞上的nAchR结合,IFA可看到荧光,但用Western-blot的方法检测不到细胞表面的nAchR蛋白。
　　应用制备的三种受体蛋白多抗用流式细胞术测定三种细胞 NA、BHK-21和RAW264.7感染RC-HL株后,NCAM、P75和nAchR三种受体蛋白的表达变化情况。结果显示,三种受体蛋白在NA细胞和BHK-21细胞中上调约2倍左右,但在RAW264.7细胞中的表达较接毒前上调更加显著,分别上调8、9和6.3倍。
　　在此基础上用实时荧光定量PCR在mRNA水平上测定NA、BHK-21和RAW264.7细胞感染RV弱毒毒株RC-HL后NCAM、P75和nAchR这三个受体的表达情况。结果表明,RC-HL感染24 h后NCAM、P75和nAchR三种基因的mRNA都有不同程度的上调。NCAM、P75和nAchR的mRNA的表达相对于接毒前,NA细胞中分别上调79.3、28.2和8.7倍,BHK-21细胞中分别上调3.5、1.9和1.8倍和RAW264.7细胞中分别上调10.97、9.1和3.5倍。
　　通过扩增三种受体基因并克隆构建原核表达载体后进行蛋白纯化,成功制备了三个受体的多克隆抗体;三种受体抗体与三种受体蛋白均有特异反应性;用制备得到的三种受体多抗检测三种细胞感染RV后,证实三种受体蛋白表达上调;RV感染后同样可以诱导这三种受体基因 mRNA表达上调,与蛋白水平结果一致。表明在狂犬病病毒感染的过程中,这三种受体扮演着重要的角色。本研究以期从受体角度阐明病毒入侵机制提供一定的研究基础和参考数据。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1.1 狂犬病概述

1.2 狂犬病病毒的概述

1.3 狂犬病病毒的发病机理

1.4 狂犬病病毒受体

1.5 本课题研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 技术路线

2.3 实验方法

第三章 实验结果与分析

3.1 狂犬病病毒受体NCAM的原核表达及多克隆抗体的制备

3.2 狂犬病病毒受体nAchR的原核表达及多克隆抗体的制备

3.3 P75的原核表达及多克隆抗体的制备

3.4 用制备得到的多抗检测RV感染细胞后NCAM、nAchR及P75受体表达量的变化

3.5 实时荧光定量PCR证实NA、BHK-21以及RAW264.7细胞感染RV后各受体mRNA变化情况是否与蛋白表达变化情况一致

第四章 讨论

4.1 构建NCAM、nAchR、P75原核表达的策略

4.2 重组蛋白的纯化

4.3 多克隆抗体反应性与特异性的鉴定

4.4 狂犬病病毒弱毒株 RC-HL 感染 NA、BHK-21、RAW264.7 细胞后NCAM、nAchR及P75的表达

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文