低氧对水牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响

摘要

卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM)和胚胎体外培养(In VitroCulture，IVC)是胚胎体外生产的关键技术环节。近年来，虽然二者均已取得了长足进展，但体外生产的胚胎发育潜力仍较体内胚胎低。本研究旨在研究低氧分压对水牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响，同时初步探讨低氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor，HIF)通过糖代谢途径对水牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的分子机制，以期通过模拟体内卵母细胞成熟和胚胎发育的理化环境来优化卵母细胞和早期胚胎体外培养体系中的气相环境，从而提高水牛卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养的效率。
　　首先研究了低氧分压对水牛卵母细胞体外成熟的影响，并初步探讨了低氧分压通过HIF调节的低氧通路及糖代谢影响水牛卵母细胞体外成熟的作用机制。结果显示:水牛卵冠丘复合物(Cumulus-Oocyte Complexes，COCs)在不同低氧分压(2％O2、3.5％O2、5％O2、6.5％O2)环境中体外成熟培养时，相对于常氧(20％O2)组，5％O2和6.5％O2组对卵母细胞的成熟率无显著影响（50.73％ vs55.31％，49.58％ vs55.31％，P＞0.05），而2％O2和3.5％O2组卵母细胞的成熟率均显著降低(21.22％ vs55.31％，29.71％ vs55.31％，P＜0.05);与常氧(20％O2)组相比，2％O2、3.5％O2、5％O2组COCs卵丘细胞扩展指数显著增高(2.84 vs2.70，2.88 vs2.70，2.89 vs2.70，P＜0.05），而6.5％O2组对COCs卵丘细胞扩展指数无显著影响(2.74 vs2.70，P＞0.05)。水牛COCs在5％O2和20％O2条件下体外成熟培养后进行体外受精(In Vitro Fertilization，IVF)，获得的胚胎在20％O2中体外培养，结果发现:与常氧(20％O2)组相比，COCs在低氧(5％O2)条件下IVM组能显著提高其IVF早期胚胎的8-cell分裂率和囊胚发育率(44.88％ vs38.47％，26.81％ vs15.60％，P＜0.05)。对HIF1α和HIF2α进行免疫荧光检测结果发现:在IVM前水牛COCs的卵丘细胞及在不同氧分压(5％O2、20％O2)条件下IVM后的卵丘细胞上均有HIF1α和HIF2α的表达;而在IVM后的卵母细胞中HIF1α均有表达，HIF2α几乎不表达。进一步进行实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，Q-PCR)分析，结果显示:在低氧(5％O2)环境中体外成熟培养水牛COCs，显著上调了COCs中卵丘细胞HIF1α、HIF2α、FSH的受体(FSHR)、IGF1的受体(IGF1R)、FOXO1、VEGF及其受体(VEGFR1、VEGFR2)、糖代谢相关基因(GLUT1、LDHA、G6DP)、热休克因子(HSP70、HSP90)和五聚环蛋白-3(Ptx3)的mRNA水平(P＜0.05)，且显著下调了前列腺素内过氧化物合酶-2(Ptgs2)及凋亡相关基因Bax和Bcl2的mRNA水平(P＜0.05)。TUNEL检测结果亦发现，水牛COCs在低氧(5％O2)中体外成熟培养，能显著降低其卵丘细胞的凋亡率(21.84％ vs30.87％，P＜0.05)。
　　随后，探讨了低氧分压(5％O2)体外培养水牛体外早期胚胎对其发育能力的影响，并对低氧通路中HIF的调控路径及其通过无氧糖酵解影响水牛早期胚胎发育的作用机制进行了初步研究。水牛COCs在5％O2中IVM后进行IVF，受精卵分别在不同氧分压(5％O2、20％O2)条件下进行IVC，并收集囊胚，结果发现:低氧(5％O2) IVC(M5C5)组的胚胎发育到2-cell、4-cell和8-cell的比率均显著高于常氧(20％O2) IVC(M5C20)组(72.38％vs68.98％，62.32％ vs57.18％，49.65％ vs45.23％，P＜0.05)，但两组的囊胚发育率差异不显著（27.24％ vs26.11％，P＞0.05）;免疫荧光分别检测两组囊胚中HIF1α和HIF2α的表达情况，结果表明:HIF1α有表达，而HIF2α几乎不表达;经Q-PCR分析发现:相对于M5C20组，M5C5组囊胚中HIF1α及调控其表达的相关基因(IGF1R、FOXO1)、糖代谢相关基因（GLUT1、LDHA、G6PD）、热休克因子(HSP70/90)和抗凋亡基因（Bcl2）的mRNA水平显著上调(P＜0.05)，而促凋亡基因(Bax)的mRNA水平显著下调(P＜0.05)。TUNEL检测结果亦发现，M5C5组囊胚细胞的凋亡率显著低于M5C20组(3.89％ vs6.90％，P＜0.05)。
　　上述结果表明:(1)HIF1α在水牛COCs的卵丘细胞和卵母细胞以及囊胚中均有表达，而HIF2α仅在水牛COCs的卵丘细胞中有表达;(2)低氧分压(5％O2)条件有利于水牛COCs的体外成熟及其IVF早期胚胎的体外发育;(3)在低氧分压(5％O2)条件下，FSH和IGF1可能通过PI3K/AKT途径调节低氧通路的核转录因子HIF1α稳定表达，稳定表达的HIF1α可能又通过促进无氧糖酵解有利于水牛卵丘细胞和早期胚胎适应低氧环境，促进水牛卵丘细胞的扩展与增殖、上调发育相关基因的表达、抑制细胞的凋亡，进而促进水牛卵母细胞的成熟，并提高其早期胚胎的发育潜力。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1 卵母细胞的体外成熟

1．1 卵母细胞的发生与成熟

1．2 卵母细胞的体外成熟培养及其影响因素

1．3 促进哺乳动物卵母细胞体外成熟的方法

2 早期胚胎的体外培养及其影响因素

3 氧分压对卵母细胞和早期胚胎发育的影响

4 低氧诱导因子及其调控机制

4．1 HIF的分类和结构

4．2 HIF的活性调节

4．3 HIF调控卵母细胞成熟和早期胚胎发育

5 展望

6 研究目的和意义

第二部分 实验部分

第一章 低氧分压对水牛卵母细胞体外成熟的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 分析与讨论

4 结论

第二章 低氧分压对水牛早期胚胎体外发育的影响

1 试验材料与方法

2 试验结果

3 分析与讨论

4 结论

全文结论

参考文献

英文缩略词

致谢

攻读学位期间发表论文情况