鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E基因在重组杆状病毒中的构建和初步表达

摘要

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病，严重危害养殖业的健康发展，现有疫苗在免疫效果、安全性等发面均存在缺陷，研制高效安全的IBV新型疫苗十分必要。
　　病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)疫苗是由病毒的一个或多个结构蛋白自动组装而成但不含病毒核酸的空壳结构，具有安全性高、免疫原性好的优点，是一种重要的新型疫苗。目前IBV病毒样颗粒疫苗的研究非常有限。
　　与其它表达系统比较，昆虫杆状病毒表达系统具有良好的翻译后加工能力，可同时表达多种外源蛋白，并且昆虫细胞易于进行悬浮培养，有利于大规模生产，目前已广泛用于疫苗研制等方面。研究表明，在昆虫杆状病毒表达系统中引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(honey bee melittin signal peptide，HBM)可使重组蛋白高效、分泌性表达且具有天然蛋白活性。
　　本研究以IBV广西优势血清型毒株GX-YL5为研究对象，应用昆虫杆状病毒表达系统并引入HBM，将GX-YL5的M蛋白与E蛋白进行单表达与共表达，为下一步IBV病毒样颗粒疫苗的研制奠定基础，具体研究内容如下:
　　一、通过融合PCR的方法将HBM与IBV的M、E基因进行融合，获得HBM1-M、HBM2-E和HBM1-E1，连接T载体酶切后各自连接到双元转座载体pFastBacTMDual的PH或p10启动子处，转化DH10Bac，转座后筛选纯化获得重组杆状rHBM1-M、rHBM2-E和rHBM1-E1。
　　二、将融合的HBM1-M和HBM2-E连接T载体酶切后分别连接到双元转座载体pFastBacTMDual的PH和p10启动子处，转化DH10Bac，转座后筛选纯化获得共表达M、E蛋白的重组杆状rHBM-M-E。
　　三、将构建的4个重组杆状rHBM1-M、rHBM2-E、rHBM1-E1和rHBM-M-E转染Sf9昆虫细胞，间接免疫荧光试验显示4个重组杆状病毒均能够在Sf9细胞中表达相应的蛋白。
　　综上所述，本研究构建了包含GX-YL5IBV毒株M和E基因的4个重组杆状病毒表达载体，并成功地在Sf9昆虫细胞中表达出相应的蛋白，为研究M、E蛋白的生物学功能和下一步IBV病毒样颗粒疫苗的研制打下了基础。
　　本研究的创新点是首次利用昆虫杆状病毒表达系统构建了共表达IBVM和E蛋白的重组杆状病毒，并引入了昆虫细胞能够识别的HBM信号肽，为今后研制IBV新型疫苗奠定基础。

目录

声明

摘要

缩写、符号说明

第一章 文献综述

1．1 鸡传染性支气管炎概述

1．1．1 IBV的分类

1．1．2 IBV的结构蛋白及生物学功能

1．2 IBV疫苗的种类

1．2．1 灭活疫苗

1．2．2 弱毒疫苗

1．2．3 亚单位疫苗

1．2．4 基因重组载体疫苗

1．2．5 DNA疫苗

1．3 杆状病毒表达系统概述

1．3．1 杆状病毒表达系统简介

1．3．2 Bac-to-Bac系统

1．3．3 杆状病毒表达系统在疫苗研制中的应用

1．3．4 蜂素信号肽

1．4 杆状病毒表达系统在常见冠状病毒疾病中的应用

1．4．1 鸡传染性支气管炎病毒

1．4．2 其他常见冠状病毒

1．5 本课题研究的目的和意义

第二章 鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E蛋白在重组杆状病毒中的单表达

2．1 材料

2．1．1 IBV毒株

2．1．2 载体、菌株与细胞

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．1．5 常用培养基、试剂的配制

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 目的基因的扩增

2．2．3 重组克隆载体的构建与鉴定

2．2．4 重组转座载体的构建与鉴定

2．2．5 重组杆粒的获取及纯化

2．2．6 重组杆粒转染Sf9昆虫细胞

2．2．7 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定

2．2．8 IFA检测目的蛋白表达

2．3 结果

2．3．1 目的基因的扩增

2．3．2 重组克隆载体的构建与鉴定

2．3．3 重组转座载体的构建与鉴定

2．3．4 重组杆粒的获取及纯化

2．3．5 重组杆状病毒感染Sf9细胞

2．3．6 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定

2．3．7 IFA检测蛋白表达情况

2．4 小结与讨论

2．4．1 获得重组杆状病毒rHBM1-M、rHBM2-E和rHBM1-E1

2．4．2 重组杆状病毒的构建策略

2．4．3 重组杆状病毒的纯化方法

2．4．4 重组杆状病毒在研制IBV新型疫苗中的应用

第三章 鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E蛋白在重组杆状病毒中的共表达

3．1 材料

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 HBM1、HBM2、M和E基因的获得

3．2．3 重组克隆载体的构建与鉴定

3．2．4 重组转座载体pFast-HBM-M-E的构建与鉴定

3．2．5 重组杆粒rHBM-M-E的获取及纯化

3．2．6 重组杆粒转染Sf9昆虫细胞

3．2．7 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定

3．2．8 IFA检测目的蛋白表达

3．3 结果

3．3．1 目的基因的扩增

3．3．2 重组克隆载体的构建与鉴定

3．3．3 pFast-HBM-M-E的构建与鉴定

3．3．4 rHBM-M-E的获取及纯化

3．3．5 重组杆状病毒感染Sf9细胞

3．3．6 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定

3．3．7 IFA检测蛋白表达情况

3．4 小结与讨论

3．4．1 获得重组杆状病毒rHBM-M-E

3．4．2 构建VLPs表达系统的选择

3．4．3 VLPs疫苗在家禽疾病中的应用前景

第四章 结论

创新点

参考文献

致谢

个人简历

攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目

附录