一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其应用

摘要

本发明涉及一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其应用，属于生物技术领域。所述重组杆状病毒，由以下方法制备：获得S基因，构建及鉴定重组转移载体pFastBacI-S，构建及鉴定重组穿梭载体AcIBV-SBacmid，重组穿梭载体感染Sf9昆虫细胞，获得表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒vAcIBV-S。本发明还提供所述重组杆状病毒在检测鸡传染性支气管炎病毒抗体方面的应用。该重组杆状病毒，能够用于检测鸡传染性支气管炎病毒抗体，避免了活病毒作为抗原易散毒的危险。采用该重组杆状病毒检测鸡传染性支气管炎病毒抗体，可用于大批量检疫，特别适合基层检疫部门使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是由冠状病毒科(Coronavirndae)、冠状病毒属(Coronavirus)的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统以及泌尿生殖系统，引起鸡咳嗽、喷嚏、气管罗音、呼吸困难、肠炎、产蛋数量和质量下降等症状。各种日龄、性别的鸡均易感染，但主要侵害1～4W雏鸡，死亡率高达40％～90％。该病引起饲料报酬降低，死淘率增加，饲养效益低所致损失甚至大于鸡的死亡损失，对养鸡业造成重大危害。目前，该病已呈世界范围流行，成为严重危害世界养禽业的重大传染病之一。

IBV是冠状病毒科的代表株，其基因组为不分节段的正链单股RNA，长约27.6kb。病毒基因组RNA共编码3种结构蛋白：纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、纤突蛋白(S)。S蛋白是IBV在免疫学上重要的蛋白。S蛋白与宿主细胞纤突上受体的结合是IBV吸附细胞的前提条件，其作用表现为：刺激机体产生中和抗体、决定病毒的组织嗜性；在病毒与细胞吸附过程中起重要作用；在病毒血清学分类中起重要作用。

由于IBV血清型繁多(已发现20多个血清型)，流行因素复杂，为有效控制其发生，急需做好该病的早期诊断和疫情监测，其主要方法是用适当抗原检测鸡血清中的特异性抗体。我国已建立了以全病毒为抗原的间接ELISA(I-ELSIA)和血凝抑制试验等方法检测鸡群IBV抗体，但这些方法不适合大批检疫和基层使用，且用活病毒作为抗原易散毒。

与原核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以对外源蛋白进行多种翻译后加工和修饰，表达重组蛋白更接近天然结构。为此，本研究采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统对传染性支气管炎病毒S基因进行表达，构建了含有S基因完整开放阅读框的重组杆状病毒。将重组杆状病毒浓缩后作为包被抗原，制备ELISA检测试剂盒，检测血清中IBV的抗体水平。

发明内容

本发明提供一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒及其用于检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的应用，采用该重组杆状病毒进行检测，适合大批检疫和基层使用，并且避免了活病毒作为抗原易散毒的危险。

本发明提供一种表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒，由以下方法制备：

(1)获得S基因(纤突蛋白基因)：从感染病毒DS10的鸡胚的尿囊液中提取RNA，以该RNA为模板，采用下游引物SR进行反转录，获得cDNA；以该cDNA为模板，采用上游引物SF、下游引物SR进行PCR反应，获得鸡传染性支气管炎病毒S基因；

所述上游引物SF为5’-CGGGATCCATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTT-3’

所述下游引物SR我5’-CCGTCGACTTA AACAGACTTTTTCGGTCTGTATTG-3’；

(2)构建及鉴定重组转移载体pFastBacI-S：将所述S基因插入pFastBacI载体，然后转化入DH5α感受态细胞，采用抗生素平板筛选获得重组子，将该重组子进行酶切，然后电泳，鉴定为阳性的重组子所含有的重组质粒即为重组转移载体pFastBacI-S；

(3)构建及鉴定重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid：将重组转移载体pFastBacI-S转化进含穿梭质粒Bacmid的DH10Bac细胞，经蓝白斑筛选获得含有重组S Bacmid 的DH10Bac细胞；提取重组S Bacmid的DNA，采用M13上游引物和下游引物进行PCR，电泳后鉴定为阳性的，则该重组S Bacmid为重组穿梭载体AcIBV-S Bacmind (如图2所示)；

所述M13上游引物为5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

所述M13下游引物为5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；

(4)重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid感染Sf9昆虫细胞，获得表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒vAcIBV-S。

本发明还提供所述重组杆状病毒在检测鸡传染性支气管炎病毒抗体方面的应用。

本发明采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统对传染性支气管炎病毒S基因进行表达，构建了含有S基因完整开放阅读框的重组杆状病毒。该重组杆状病毒，能够用于检测鸡传染性支气管炎病毒抗体，避免了活病毒作为抗原易散毒的危险。采用该重组杆状病毒检测鸡传染性支气管炎病毒抗体，可用于大批量检疫，特别适合基层检疫部门使用。

附图说明

图1是质粒pMD-S酶切后的电泳图，其中DL15000是分子量MARK。

图2是重组子pFastBacI-S的质粒用Sal I和Hind III双酶切后的电泳图，其中DL15000是分子量MARK。

图3是采用M13上、下游引物对重组穿梭载体AcIBV-S Bacmind的DNA进行PCR后的电泳图，其中DL15000是分子量MARK。

图4是被重组杆状病毒vAcIBV-S感染后的Sf9昆虫细胞的荧光显微镜照片。

具体实施方式

实施例1表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒的制备

(1)材料来源

限制性内切酶Sal I、BamH I、T₄ DNA连接酶、Ex-Tag DNA聚合酶、pMD18均购自宝生物科技有限公司。

本实施例中以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株为模板，扩增其纤突蛋白基因(S基因)，该病毒命名为Ck/Jiansu/DS10/2008，简称病毒DS10，其微生物保藏号是：CGMCC No.3957。

保藏信息如下：

生物材料(毒株)：Ck/Jiangsu/DS10/2008

分类命名：鸡传染性支气管炎病毒

拉丁文学名：Infectious Bronchitis Virus(IBV)

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2010年6月25日

保藏编号：CGMCC No.3957

(2)引物的设计

将Genbank中IBV的S基因序列经多重比对后设计引物。根据真核表达载体pFastBacI上的酶切位点，将上游引物设计在起始密码子处，并加上BamH I酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上Sal I酶切位点。

上游引物SF：5’-CGGGATCCATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTT-3’

下游引物SR：5’-CCGTCGACTTAAACAGACTTTTTCGGTCTGTATTG-3’

(3)S基因获得：从感染病毒DS10的鸡胚的尿囊液中提取RNA，以该RNA为模板，采用下游引物SR进行反转录，获得cDNA；以该cDNA为模板，采用上游引物SF、下游引物SR进行PCR反应，获得鸡传染性支气管炎病毒S基因；

具体步骤如下：

扩增目的基因：将病毒DS10经尿囊腔接种SPF鸡胚，收取该鸡胚的尿囊液，提取RNA，采用下游引物SR进行反转录，获得cDNA。以获得的cDNA为模版，加入Ex-Tag DNA聚合酶、上游引物SF、下游引物SR、dNTP进行扩增反应，获得PCR产物。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见大小约为3500bp的扩增条带，与病毒DS10的S基因一致。

鉴定目的基因：将PCR产物通过T4DNA连接酶与pMD18载体相连，转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得阳性菌，提取质粒，采用BamH I和Sal I双酶切质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶，可见约3500bp(病毒DS10的S基因)和2700bp(pMD18载体)两条带。将含有目的基因的质粒命名为pMD-S(如图1所示)，测获得病毒DS10的S基因序列。

(4)构建及鉴定重组转移载体pFastBacI-S：将所述S基因插入pFastBacI载体，然后转化入DH5α感受态细胞，采用抗生素平板筛选获得重组子，将该重组子进行酶切，然后电泳，鉴定为阳性的重组子所含有的重组质粒即为重组转移载体pFastBacI-S。

具体步骤如下：将质粒pMD-S用Sal I和Hind III双酶切获得S基因，胶回收目的片断，约3500bp；将pFastBacI载体采用BamH I和Sal I双酶切，胶回收目的片断，约5000bp。分别取胶回收的目的片断通过T₄ DNA连接酶连接，转化入DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选获得能够生长的重组子，将该重组子中的质粒用Sal I和Hind III双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现在3500bp和5000bp附近分别有特异性条带，大小与预期结果一致，因此获得阳性重组子，所含有的重组质粒即为重组转移载体pFastBacI-S。(如图2所示)

(5)构建及鉴定重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid：将重组转移载体pFastBacI-S转化进含穿梭质粒Bacmid的DH10Bac细胞，经蓝白斑筛选获得含有重组S Bacmid 的DH10Bac细胞；提取重组S Bacmid的DNA，采用M13上游引物和下游引物进行PCR、电泳后鉴定为阳性的，则该重组S Bacmid为重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid。

具体方法如下：将重组转移载体pFastBacI-S转化进含穿梭质粒Bacmid的DH10Bac细胞，在含有50ug/ml KanaSycin(卡那霉素)、10ug/ml Tetracycline(四环素)、7ug/ml Gentamicin(庆大霉素)、40ug/ml IPTG和200ug/ml X-gal的LB平板上筛选。挑选白斑获得含有重组S Bacmid的DH10Bac细胞，接种于含有50ug/mlKanaSycin、10uf/ml Tetracycline和7ug/ml Gentamicin的LB液体培养基中进行小量培养。按碱裂解法提取重组S Bacmid的DNA，采用M13上游引物和下游引物进行PCR鉴定，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见约5800bp扩增条带，则结果为阳性，则该重组S Bacmid为重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid。(如图3所示)。

M13上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

(6)重组穿梭载体AcIBV-S Bacmid感染Sf9昆虫细胞获得表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒vAcIBV-S

采用cell fectin脂质体，将IBV-S Bacmid转染Sf9昆虫细胞，获得表达鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的重组杆状病毒vAcIBV-S。

(7)间接免疫荧光方法鉴定重组杆状病毒vAcIBV-S：将重组杆状病毒vAcIBV-S接种Sf9昆虫细胞，5天后收获病毒。用冷甲醇(含有体积比为3∶2的丙酮、乙醇)固定细胞面5min，PBS洗涤3次，每次5min；加入用PBS稀释100倍的抗IBV多抗血清作为一抗，37℃作用1小时；弃去一抗，用PBS洗涤3次，每次5min；加入用PBS稀释200倍的兔抗鸡IgG-FITC荧光抗体作为二抗，37℃作用1h；弃去二抗，用PBS充分洗涤3次后，甩干；置荧光镜下观察是否出现特异性的黄绿色荧光，同时设立阴性对照(vAc：转染了空Bacmid的重组杆状病毒接种后的Sf9昆虫细胞)。间接免疫荧光方法鉴定的结果显示：接种了重组杆状病毒vAcIBV-S后Sf9昆虫细胞在荧光显微镜下出现特异性的荧光(如图4所示)，证明成功利用杆状病毒表达系统表达了鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白。

实施例2应用重组杆状病毒vAcIBV-S检测鸡传染性支气管炎病毒抗体

包被抗原的制备(vAcIBV-S、vAc)：将重组杆状病毒vAcIBV-S接种Sf9昆虫细胞，接种量5～10MOI(感染复数)，27℃培养5天后收获病毒vAcIBV-S。将病毒感染细胞刮下，离心10分钟(10000g)，收集沉淀，悬于原培养体积1/20的细胞裂解液(20mmol/L的Tris-HCl，150mmol/L的NaCl，pH7.4)中，浓缩20倍，制备成浓缩vAcIBV-S抗原。按照相同方法制备浓缩vAc抗原作为空白对照。

包被液：浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)。

冲洗液：含10mL/L吐温-20的PBS缓冲液。

稀释液：含10g/L脱脂奶粉和10mL/L吐温-20的PBS缓冲液。

封闭液：含10g/L牛血清白蛋白、50g/L脱脂奶粉、10g/L酪蛋白和20mL/L吐温-20的PBS缓冲液。

底物缓冲液：含有浓度为0.1M的柠檬酸、0.2M的Na₂HPO₄。

显色液：底物缓冲液5ml、H₂O 5ml、TMB(10mg/ml)100ul、体积浓度为1％的H₂O₂ 40ul混合，现用现配。

终止液：浓度为4mol/L的H₂SO₄溶液。

检测方法操作步骤：

1：用包被液将浓缩vAcIBV-S抗原及空白对照(浓缩vAc抗原)稀释到150ng包被96孔酶标板，浓缩vAcIBV-S抗原与空白对照同时隔行包被。每孔100uL，4℃过夜或37℃作用2h，用冲洗液冲洗3次。

2：加入封闭液100uL在37℃封闭1h，用冲洗液冲洗3次，待用。

3：将待检血清、IBV标准阳性血清和阴性血清(购于中国药物监察所)用稀释液1∶100稀释后，分别加入到浓缩vAcIBV-S抗原及空白对照(浓缩vAc抗原)孔中，每孔100uL，37℃作用2h后，用冲洗液冲洗3次。

4：将酶标记羊抗鸡IgG用稀释液1∶5000稀释，每孔100uL，37℃作用1h，用冲洗液冲洗3次；

5：每孔加入100uL显色液，室温反应20min，每孔加终止液30uL中止反应，在酶标检测仪490nm测OD值。

检测结果分析：

待检样品检测结果：包被浓缩vAcIBV-S抗原的OD值0.873，空白对照(浓缩vAc抗原)的OD值为0.129。与IBV标准阳性血清的0.973和0.099相差不大，而标准阴性血清的OD值为0.145和0.119。结果表明：将浓缩的vAcIBV-S抗原作为检测IBV抗体水平的检测抗原是可行的。