猪瘟病毒Npro蛋白和宿主猪IRF-1蛋白多克隆抗体制备及其相关性初步探索

摘要

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高接触传染性致死性的猪传染病，以出血和高热为特征，感染的猪群常常大量死亡，造成严重的经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属，是一种单股正链RNA病毒。Npro非结构蛋白是CSFV基因组首先翻译出来的蛋白质，具有CSFV自体蛋白酶活性，断裂后催化多聚蛋白成为12种成熟的病毒蛋白。Npro能够抑制IFN-α/β转录的干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor3，IRF3)，具有阻碍IFN-α/β诱导的作用。干扰素调节因子1(Interferon regulatoryfactor1，IRF1)是一个重要的多功能转录因子。这个转录因子家族具有调节干扰素表达、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。并且，IRF1还选择性地调节不同基因在不同细胞中的免疫应答效应。本研究在先前的工作基础上，进一步探索Npro与IRF1的相互作用关系，但目前尚没有良好的抗Npro和抗IRF1的抗体商品销售，因此要先研制猪瘟病毒Npro蛋白的抗体，以便对猪瘟病毒蛋白的结构和功能进行进一步的探讨;而制备所得的IRF-1抗体，可以为研究CSFV感染时，IRF1与干扰素、干扰素刺激应答基因(Inierferon stimulatedgenes，ISG)等各种免疫应答因子的相关关系打下基础。
　　首先扩增了猪瘟病毒基因组编码Npro蛋白基因片段和猪IRF-1基因，克隆到pMD18-T载体，再亚克隆到原核表达载体pET-32α(+)上，成功构建了重组原核表达质粒pET-Npro和pET-IRF-1。将pET-Npro、pET-IRF-1分别转到大肠杆菌Rosetta中，经IPTG诱导表达，表达的蛋白产物经SDS-PAGE和Western blot检测，证实了Npro基因和IRF-1基因得到了有效的表达。Npro蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式表达，而IRF-1主要是以可溶性蛋白形式表达。本文对Npro和IRF-1的可溶性蛋白利用镍离子(Ni+)亲和层析的方法进行纯化，将纯化所得到的Npro和IRF-1的活性蛋白作为抗原，分别按免疫程序免疫4周龄的小鼠，制备这两种蛋白的多克隆抗体。结果显示，制备的抗Npro和抗IRF-1的小鼠血清，经用Western blot检测，抗Npro和抗IRF-1的多克隆抗体，两者能够分别和原核表达重组蛋白Npro和IRF-1发生良好的反应。进一步检测多克隆抗体的特异性，Npro蛋白的多克隆抗体能够与天然构象的猪瘟病毒Npro结合。PK-15细胞感染猪瘟病毒后，用IRF-1多克隆抗体可检测到IRF-1蛋白表达的变化，并且细胞感染猪瘟病毒后48 h能检测出IRF-1的表达量较高，同时，Npro蛋白的多克隆抗体能够特异性地识别PK-15细胞中真核表达的Npro蛋白。两种抗体的最适稀释度为1∶2000，证明以上所制备的两个多克隆抗体具有良好的特异性和反应性。
　　通过制备的抗体，运用实时荧光定量PCR、Western blot技术检测感染猪瘟病毒后PK-15细胞IRF-1的变化，发现IRF-1 mRNA水平上升，采用Western blot方法证明猪瘟感染可引起IRF-1翻译水平上升，说明IRF-1在猪瘟病毒感染过程中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

主要英文缩写对照

第一章 综述

1．1 猪瘟病毒的分子生物学特性

1．2 猪瘟病毒的致病机理

1．3 猪瘟病毒Npro蛋白在感染中的作用

1．4 IRF-1

1．5 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 毒株、克隆及表达载体、菌种、细胞

2．1．3 引物合成

2．1．4 主要试剂及相关溶液配制

2．1．5 主要仪器与设备

2．2 技术路线

2．2．1 猪瘟病毒Npro蛋白和猪源IRF-1蛋白多克隆抗体制备

2．2．2 猪瘟病毒Npro蛋白与宿主猪IRF-1蛋白相关性的初步探索

2．3 实验方法

2．3．1 目的基因的克隆

2．3．2 原核表达载体的构建

2．3．3 重组蛋白的诱导表达

2．3．4 重组蛋白表达形式鉴定

2．3．5 可溶性蛋白的纯化与透析

2．3．6 重组蛋白免疫小鼠制备抗体

2．3．7 蛋白多克隆抗体特异性及效价检测

2．3．8 实时荧光定量PCR实验

第三章 实验结果

3．1 Npro蛋白原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

3．1．1 Npro基因片段的克隆

3．1．2 原核表达载体pET-Npro的构建

3．1．3 pET-NPro转化Rosetta重组菌的表达情况

3．1．4 重组蛋白Npro的纯化及鉴定

3．1．5 Westernblot检测Npro蛋白多克隆抗体特异性和反应性

3．2 IRF-1原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

3．2．1 IRF-1目的基因片段的克隆

3．2．2 原核表达载体pET-IRF-1的构建

3．2．3 pET-IRF-1转化Rosetta重组菌的表达情况

3．2．4 IRF-1重组蛋白的纯化及鉴定

3．2．5 Western blot检测IRF-1蛋白多克隆抗体特异性和反应性

3．3 猪瘟病毒Npro蛋白与宿主细胞IRF-1蛋白相关性的初步探索

3．3．1 实时荧光PCR检测猪瘟病毒对IRF-1 mRNA的影响

3．3．2 Western blot检测猪瘟病毒对IRF-1蛋白水平的影响

第四章 讨论

4．1 原核表达策略

4．2 蛋白表达条件的优化

4．3 重组蛋白的纯化

4．4 影响抗体制备的因素

4．5 验证多克隆抗体的反应性和特异性

4．6 猪瘟病毒与IRF-1相关性的初步探索

第五章 结论

参考文献

致谢

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