猪瘟病毒C、NS3蛋白多克隆抗体的制备及其与IRG6相互作用的初步探索

摘要

猪瘟病毒(CSFV, Classicsl swine fever virus)是引起猪的高度传染性致死性疾病——猪瘟的病原。CSFV感染可导致猪严重的白血球减少症、免疫抑制、广泛的血栓症和内皮损伤，给世界养猪业带来巨大的威胁和经济损失。CSFV是一种小囊膜、单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属，基因组约12.5kb，只有1个大的开放阅读框架（ORF,Open reading frame），所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，编码的多聚蛋白约4000个氨基酸残基，分子量约438kDa，在细胞和病毒蛋白酶的加工、修饰下形成12种成熟的病毒蛋白。
　　本研究小组先前的研究证实，在猪瘟病毒感染的过程中IRG6（Inflammatory response gene6 protein）的mRNA表达量一直处在非常高的水平。通过NCBI BLAST系统发现，在基因结构上IRG6与其他物种的viperin有非常高的同源性，达到83.7％，主要功能区域的同源性达到90％。蛋白质的结构和功能是密不可分的，IRG6与viperin结构上的高度同源性提示其必然在功能上与viperin有着高度相似性。在感染猪瘟病毒过程中，IRG6的mRNA高水平表达也说明其与猪瘟病毒感染的密切关系。
　　本文通过亚克隆的方法以pET-32a(+)原核表达载体为基础构建了pET-C和pET-NS3原核表达质粒。将pET-C和pET-NS3转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达，成功获得重组蛋白C和NS3。通过Ni2+的亲和层析法纯化了重组蛋白C和NS3，并将以包涵体形式表达的重组蛋白NS3进行了复性，制备出可溶性抗原，将重组蛋白C和NS3免疫小鼠制备出抗C蛋白和NS3蛋白蛋白多克隆抗体。Western blot检测C蛋白和NS3蛋白多克隆抗体，二者能够分别与重组蛋白C和NS3发生良好反应。进一步检测多克隆抗体的特异性和反应性，C蛋白多克隆抗体和NS3蛋白多克隆抗体能与天然构象的猪瘟病毒C蛋白和NS3蛋白结合，两种抗体的最适稀释度均达到1∶2000，证明所制备的两个多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。
　　运用实时荧光定量PCR技术、Western blot和IFA检测稳定转染peGFP真核表达载体的PK-15细胞系、稳定转染pIRG6-eGFP真核表达载体的PK-15细胞系和PK-15细胞发现，证实过表达IRG6蛋白会使猪瘟病毒RNA、病毒蛋白和病毒滴度水平下降，暗示IRG6可能具有抑制猪瘟病毒复制的生物学活性。

目录

声明

摘要

英文缩写对照表

一、综述

1．1 病原学

1．2 猪瘟病毒结构及其蛋白功能的特点

1．2．1 3’端非编码区

1．2．2 5’端非编码区

1．2．3 Npro

1．2．4 Core

1．2．5 Erns，E1和E2

1．2．6 P7

1．2．7 NS2，NS3

1．2．8 NS4A，NS4B

1．2．9 NS5A，NS5B

1．3 猪瘟病毒的致病机理

1．3．1 猪瘟病毒生命周期

1．3．2 猪瘟病毒致病机制

1．3．3 猪瘟病毒免疫抑制

1．4 IRG6

1．5 本研究的目的与意义

二、材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 病毒、质粒、细胞与菌株

2．1．3 引物合成

2．1．2 试剂及配制

2．1．3 仪器设备

2．2 技术路线

2．2．1 猪瘟病毒C蛋白和NS3蛋白原核表达载体的构建与多克隆抗体制备

2．2．2 猪瘟病毒与IRG6相互作用机制的初步探索

2．3 实验方法

2．3．1 扩增目的基因

2．3．2 电泳和胶回收

2．3．3 连接基因片段

2．3．4 制备TOP10感受态细胞

2．3．5 转化连接产物

2．3．6 质粒抽提及双酶切鉴定

2．3．7 制备Rosetta感受态细胞

2．3．8 构建原核表达质粒

2．3．9 重组菌的诱导表达及Western blot鉴定

2．3．10 重组蛋白表达形式的鉴定

2．3．11 蛋白的纯化与复性

2．3．12 重组蛋白免疫小鼠制备抗体

2．3．13 多克隆抗体特异性及效价检测

2．3．14 病毒的培养

2．3．15 病毒感染滴度测定方法

2．3．16 qRT-PCR

三、实验结果

3．1 C蛋白原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

3．1．1 C基因片段的克隆

3．1．2 原核表达载体pET-C的构建

3．1．3 重组质粒pET-C的诱导表达

3．1．4 重组蛋白C表达形式的鉴定

3．1．5 重组蛋白C的纯化

3．1．6 纯化的重组蛋白C的鉴定

3．1．7 Western blot检测C蛋白多克隆抗体与重组蛋白反应性

3．1．8 Western blot检测C蛋白多克隆抗体与PK-15细胞中C蛋白的反应性

3．2 NS3蛋白原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

3．2．1 NS3基因片段的克隆

3．2．2 原核表达载体pET-NS3的构建

3．2．3 重组质粒pET-NS3的诱导表达

3．2．4 重组蛋白NS3表达形式的鉴定

3．2．5 重组蛋白NS3的纯化

3．2．6 纯化的重组蛋白NS3的鉴定

3．2．7 Western blot检测NS3蛋白多克隆抗体与重组蛋白反应性

3．2．8 Western blot检测NS3蛋白多克隆抗体与PK-15细胞中NS3蛋白的反应性

3．3 猪瘟病毒与IRG6相互作用的初步探索

3．3．1 细胞系的鉴定

3．3．2 实时荧光定量PCR引物标准曲线的建立

3．3．3 过表达IRG6对猪瘟病毒RNA的影响

3．3．4 测定过表达IRG6对猪瘟病毒滴度的影响

3．3．5 测定过表达IRG6对猪瘟病毒蛋白的影响

四、讨论

4．1 基因原核表达片段的选择

4．2 原核表达策略

4．3 重组蛋白的纯化

4．4 多克隆抗体的特异性及效价问题

4．5 多克隆抗体的重要性及应用前景

4．6 猪瘟病毒与IRG6相互作用的初步探索

五、小结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文