六堡茶多酚氧化酶及其产生菌对茶叶品质的应用

摘要

六堡茶是以梧州大叶毛茶为原料，按特定的初制和精制工艺进行加工，具有“六堡香”及红、浓、陈、醇等独特品质特征的黑茶。发酵（渥堆）是六堡茶品质形成的关键，在高温、高湿度的条件下，微生物生长繁殖，以茶叶为底物发生如催化氧化茶多酚的系列反应。目前，关于六堡茶多酚氧化酶及渥堆微生物的研究很少，本文将茶叶多酚氧化酶、茶叶理化成分变化及微生物数量联系起来，深入理解渥堆时期六堡茶品质形成的过程;从六堡茶发酵样品中分离纯化得到多酚氧化酶同工酶，对其酶学特性进行研究，为后续酶促合成茶色素优化反应体系建立、酶固定化等领域提供理论指导;除此之外，从六堡茶渥堆样品中分离鉴定出的产多酚氧化酶嗜热菌，被应用于茶叶固体发酵模拟实验，对比无菌、传统及单菌株发酵对茶叶成分的转化效果，进一步说明了六堡茶渥堆时期色、香、味等品质成分形成的机理。本研究得到的实验结果如下: 1、水浸出物是茶汤的主要呈味、呈色物质，它的含量与多酚氧化酶酶活高度正相关(r=0.8776)。渥堆时期茶叶茶多酚含量从16.6％降至8.2％，随着后期多酚氧化酶酶活升高，茶多酚下降速度加快，而游离氨基酸从40.1mg/g下降至9.9mg/g。在六堡茶渥堆过程中，茶黄素和茶红素均呈现下降趋势，分别从0.12％下降至0.05％和从5.24％下降至0.74％，茶褐素从2.53％上升至5.77％，分析出现这种变化的原因是多酚氧化酶酶活升高，催化了茶黄素、茶红素的进一步氧化。另外，六堡茶渥堆过程中的多酚氧化酶酶活与霉菌的数量同样呈高度正相关(r=0.9192)。多酚氧化酶酶活总体呈上升趋势，但渥堆前毛茶的多酚氧化酶经过杀青工艺已经钝化或失活，推测新的多酚氧化酶可能是由微生物产生。综上，多酚氧化酶对六堡茶品质形成起着重要作用。 2、对六堡茶多酚氧化酶的提取进行优化，然后将渥堆前后两种茶样的粗酶液进行硫酸铵分级沉淀、选择合适的盐析饱和度、浓缩、经凝胶过滤层析将制得的样品进行SDS-PAGE分析。渥堆前毛茶PPO分子量在59kDa左右，而渥堆结束的茶叶样品出现了分别约为59kDa和70kDa的条带。分析这是因为渥堆过程中微生物作用产生了新的PPO，且该种PPO可能是真菌产生的漆酶。分子量为70kDa的PPO1的最适pH值为6.5、最适温度40℃、最适底物（邻苯二酚）浓度为0.5mol/L。分子量为59kDa的PPO2的最适pH值为6.0、最适温度35℃、最适底物（邻苯二酚）浓度为0.5mol/L。 3、利用传统培养法首次从渥堆茶样分离鉴定出嗜热菌，其中细菌5个属，14个种;霉菌5个属，9个种。通过选择性培养基颜色变化和液态培养酶活测定筛选出三株产多酚氧化酶嗜热菌，分别为Lichtheimia corymbifera（伞状毛霉菌）、Aspergillus tubingensis（塔宾曲霉）和Aspergillus fumigatus（烟曲霉）。此外，还通过液态发酵基础培养和茶汁培养绘制出目前课题组已从六堡茶中分离出的5种活性最强的多酚氧化酶产生菌的产酶曲线图。 4、选择Penicillium griseofulvum（灰黄青霉）、Aspergillus niger（黑曲霉）、Aspergillus fumigatus（烟曲霉）进行茶叶固体发酵实验，对多酚氧化酶产生菌在茶叶生物转化效果的应用进行研究。实验样品分为无菌、传统和三种单菌株发酵组，对40天内它们的茶色素、茶多酚及多酚氧化酶酶活变化进行测定。从生长情况上看，黑曲霉、烟曲霉比灰黄青霉和未灭菌的毛茶微生物更能在高温高湿的固体茶叶环境下良好生长。三种菌株发酵组的酶活均高于传统发酵和无菌发酵组。随着模拟发酵时间的增加，每组的茶多酚含量均出现不同程度的降低，其中烟曲霉发酵组对茶多酚的转化效果最为明显，传统发酵组次之。各发酵组的茶黄素含量均随着时间的增长而下降。传统发酵组、无菌组、灰黄青霉发酵组的茶红素、茶褐素呈现出明显的增长趋势。而烟曲霉组和黑曲霉组的茶红素下降，茶褐素上升。

目录

声明

摘要

第一章导论

1．1六堡茶概述

1．2黑茶成分及其渥堆发酵过程中的变化

1．2．1茶多酚

1．2．2茶色素

1．2．3游离氨基酸

1．2．4水浸出物

1．3黑茶微生物的研究现状

1．3．1微生物在黑茶发酵过程的作用

1．3．2六堡茶中微生物的研究进展

1．3．3茶叶产多酚氧化酶菌株

1．4多酚氧化酶概述

1．4．1多酚氧化酶的分类

1．4．2多酚氧化酶的提取、分离和纯化

1．4．3多酚氧化酶的物种特异性和酶学特性

1．4．4茶叶加工中多酚氧化酶的应用

1．4．5黑茶中产多酚氧化酶微生物的相关研究

1．4．6多酚氧化酶的新技术

1．5研究目的、意义和内容

1．5．3研究内容

第二章六堡茶渥堆时期多酚氧化酶和茶叶品质成分的变化

2．1实验材料来源、仪器设备及主要试剂

2．1．1实验材料来源与保存

2．1．2仪器设备

2．1．3试验所需试剂

2．2实验方法

2．2．1茶叶多酚氧化酶的提取与测定

2．2．2茶叶可溶性蛋白质的测定

2．2．3茶多酚含量的测定

2．2．4茶色素含量的测定

2．2．5茶叶游离氨基酸的测定

2．2．6茶叶水分活度、含水率的测定

2．2．7茶叶水浸出物的测定

2．2．8茶汤色度的测定

2．2．9茶叶微生物数量的测定

2．3结果与分析

2．3．1六堡茶多酚氧化酶酶活及可溶性蛋白质的变化

2．3．2六堡茶渥堆时期茶多酚含量的变化

2．3．3六堡茶渥堆时期游离氨基酸含量的变化

2．3．4六堡茶渥堆时期水分活度和含水率的变化

2．3．5六堡茶渥堆时期水浸出物含量的变化

2．3．6六堡茶渥堆时期茶汤色度及茶色素的变化

2．4．9渥堆过程中微生物类群的数量变化

2．4本章小结

第三章六堡茶多酚氧化酶同工酶的分离鉴定及酶学性质

3．1实验原料、仪器设备及主要试剂

3．1．1实验原料

3．1．2仪器设备

3．1．3主要试剂

3．2实验方法

3．2．1茶叶多酚氧化酶的提取优化

3．2．2茶叶多酚氧化酶的分离纯化

3．2．3同工酶酶学特性的研究

3．3结果与讨论

3．3．1六堡茶多酚氧化酶粗酶液的提取优化

3．3．2六堡茶多酚氧化酶的分离与纯化

3．3．3六堡茶多酚氧化酶同工酶的酶学性质

3．4本章小结

第四章六堡茶产多酚氧化酶嗜热菌的筛选

4．1实验材料、仪器和主要试剂

4．1．1实验原料

4．1．2主要仪器

4．1．3实验试剂

4．2实验方法

4．2．1六堡茶嗜热菌的分离

4．2．2嗜热菌的分子学鉴定

4．2．3产多酚氧化酶的嗜热菌筛选

4．2．4产多酚氧化酶菌株的产酶活力曲线绘制

4．3结果与讨论

4．3．1六堡茶渥堆过程中嗜热菌的分子学鉴定结果

4．3．2产多酚氧化酶的嗜热菌筛选

4．3．3多酚氧化酶产生菌的产酶活力曲线绘制

4．4本章小结

第五章多酚氧化酶产生菌对茶叶的固体发酵应用

5．1实验原料、仪器、试剂

5．1．1实验原料

5．1．2实验仪器

5．1．3实验试剂

5．2实验方法

5．2．1氧化酶产生菌粗酶液对茶汤的转化作用

5．2．2多酚氧化酶产生菌的茶叶固体发酵应用

5．3结果与讨论

5．3．1多酚氧化酶产生菌粗酶液对茶汤的转化作用

5．3．2固体发酵模拟实验多酚氧化酶酶活的测定

5．3．3固体发酵模拟实验茶多酚含量的测定

5．3．4固体发酵模拟实验茶色素含量的测定

5．4本章小结

第六章结论与展望

6．1全文总结

6．2创新点

6．3展望

参考文献

致谢