siRNA干扰人胃癌细胞株SGC-7901 COX-2的表达抑制胃癌复发和肝转移的临床和实验研究

摘要

第一部分COX-2和Ki-67及MVD在胃癌组织中的表达及其与胃癌肝转移及胃癌复发关系的研究 目的：研究胃癌组织中COX-2、Ki-67的表达和微血管密度(MVD)，探讨与胃癌肝转移和胃癌复发关系密切的临床病理因素和免疫生化指标，探索胃癌肝转移和复发的规律，为胃癌治疗和随访提供指导。 方法：回顾性分析手术切除的胃癌肝转移病例31例和48例胃癌复发病例的病理特征，并任取48例无肝转移、无复发病例作对照组。用免疫组织化学方法检测胃癌标本中COX-2、Ki-67的表达和微血管密度(MVD)，并分析三者之间及其与临床病理因素之间的相关性。用单因素和多因素分析研究影响胃癌肝转移和胃癌复发的相关因素。 结果 (1)全组胃癌COX-2蛋白阳性率为88.2％，肝转移组、复发组和对照组分别为100％、85.4％和83.3％，而且肝转移组、复发组和对照组强阳性率分别为83.9％、52.1％和29.2％。 (2)COX-2、Ki-67LI和MVD相互之间具有极强的相关性，并且三者都与肿瘤的浸润深度、TNM分期、肝转移、淋巴结转移和周围脏器受累密切相关；COX-2和Ki-67LI都与存在腹水、腹膜侵犯和Borrmann分型高度相关；除此之外，COX-2还与盆腔转移结节、肿瘤长径相关，MVD与胃癌复发相关，Ki-67LI与肿瘤长径、浆膜浸润情况和肿瘤细胞的分化程度都存在具有统计学意义的相关性。 (3)胃癌病例有腹水存在、盆腔转移结节形成、侵犯腹膜、肿瘤部位在胃体或全胃、淋巴结转移、累及周围脏器以及肿瘤TNM分期Ⅲ或Ⅳ期、浸润深度T4期、COX-2强阳性、MVD增加者肝转移明显增加，是胃癌肝转移的危险因素；侵犯腹膜、盆腔转移结节、TNM分期和MVD是胃癌肝转移最重要的四个影响因素。浸润深度、盆腔转移结节、COX-2蛋白强阳性和MVD与胃癌复发密切相关，是胃癌复发的高危因素。 (4)对照组、复发组和肝转移组胃癌生存率比较有极显著差异，与对照组相比较，复发组和肝转移组胃癌生存率明显减低，均有极显著统计学意义差异。初发胃癌的浸润深度、盆腔转移结节、存在腹水以及胃癌标本中COX-2含量增高是胃癌术后生存率降低的危险因素。 结论 (1)腹膜侵犯、盆腔转移结节、TNM分期和MVD是影响胃癌肝转移最重要的因素，浸润深度、盆腔转移结节、COX-2蛋白强阳性和MVD与胃癌复发密切相关，是胃癌复发的高危因素。 (2)COX-2与Ki-67LI和MVD相互之间具有极强的相关性，并且三者都与肿瘤的浸润深度、TNM分期、肝转移、淋巴结转移和周围脏器受累密切相关。 (3)COX-2、浸润深度、盆腔转移结节和存在腹水是影响胃癌病人生存率的主要因素，与胃癌病人的预后有关。 (4)检测临床病理和生物化学指标可能预测胃癌肝转移和胃癌复发的发生，靶向于COX-2和微血管形成的治疗可能提高胃癌病人的预后。 第二部分RNA干扰靶向抑制胃癌SGC-7901细胞COX-2基因和蛋白表达方法的建立 目的：应用特异、高效并且方法简单的RNAi技术，选择在胃肠道肿瘤中广泛存在、与肿瘤细胞生物学特性(肿瘤细胞的增生、凋亡、侵袭和粘附)息息相关，影响胃癌的发生和发展的COX-2作为靶点，建立有效的RNA干扰方法。 方法购置和培养高转移性胃癌细胞株SGC7901细胞，对其COX-2基因进行克隆、鉴定和测序，并与基因库中COX-2基因进行序列对比。根据所克隆COX-2基因用Sfold软件设计了6条针对COX-2基因不同部位的siRNA，同时设计一条阴性对照siRNA，将选择的序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行BLAST序列比对，确信所选择的序列与其他的基因不具有同源性，并用化学方法合成。 结果 (1)测序结果表明：胃癌SGC7901细胞中克隆的COX2基因经拼合后有1931bp，所克隆序列和genbank中COX-2标准序列(genebankNo.NM_000963)对比显示：共6处7个碱基不同，没有缺失和插入。 (2)lipofectamin2000和TOPtransfection介导的pcDNA3.1/His/lacZ质粒和pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA可以有效的转染肝癌HepG2细胞，细胞转染率分别达到56％和68％。lipofectamin2000和TOPtransfection介导的pcDNA3.1/His/lacZ质粒和pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA可以有效转染胃癌SGC7901细胞，细胞转染率分别达到49％和55％。因此选择TOPtransfection介导COX-2-siRNA，进行靶向抑制胃癌SGC7901细胞COX-2表达的实验研究。 (3)COX-2(0-5)和阴性对照siRNA转染胃癌SGC7901细胞24hr后，测得COX-2mRNA拷贝数分别为3.5、4.75、11.53、6.45、17.08、12.33和209.1，与阴性对照相比，每条siRNA都有很好的基因敲除效果，最强干扰效果达98.3％，最低也在90％以上；COX-20-siRNA转染胃癌7901细胞后24hr干扰效果最好，与对照组相比，抑制COX-2mRNA表达96.9％，48hr和72hr抑制率分别为86.3％和41.9％；0.2ug、0.4ug和0.6ugCOX20-siRNA转染胃癌7901细胞24hr后COX2mRNA表达的抑制率分别为96.9％、96.1％和97.6％；COX-20-siRNA转染胃癌7901细胞后24hrCOX-2蛋白抑制率为71.5％。 结论 (1)本研究证实高转移性胃癌细胞株SGC-7901细胞中能克隆出完整的COX-2基因，其序列与文献报道一致。 (2)TOPtransfection介导报告基因pcDNA3.1/His/lacZ质粒转染胃癌SGC-7901细胞和肝癌HepG2细胞以及转染报告基因siRNA(pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA)对报告基因lacZ的抑制效果优于lipofectamin2000。 (3)TOPtransfection介导的COX-2-siRNA能够有效抑制胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白的表达，这种抑制效果在转染后24hr最强，随着时间的推迟抑制效果减弱，但是不随siRNA浓度的变化而波动。 第三部分靶向COX-2的RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞和裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用 目的：在建立有效的RNA干扰方法的基础上，探讨靶向COX-2的RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞增生和凋亡的影响以及对裸鼠皮下种植瘤的抑制作用，建立胃癌及其复发和转移基因治疗的新方法。 方法COX-20-siRNA和阴性对照siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后24hr，用荧光定量PCR和Westernblotting方法检测细胞中COX2mRNA拷贝数和蛋白含量，同时用流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡情况，并与未经转染的胃癌细胞做对比。同样用三组细胞接种裸鼠皮下，8周后处死裸鼠，剥离瘤体，测量肿瘤体积、重量和抑瘤率；同时用荧光定量PCR和Westernblotting检测皮下种植瘤中COX-2mRNA拷贝数以及COX-2和ki-67蛋白的表达。 结果 (1)与对照组和阴性对照组相比，实验组胃癌细胞有很好的基因敲除效果，干扰效果达到97.8％和97.7％；阴性对照组COX-2蛋白无明显变化，实验组COX-2蛋白抑制率为70.9％。 (2)实验组、阴性对照组及对照组胃癌细胞凋亡率分别为(n=8)：22.28±3.62、1.23±0.27和1.03±0.14。试验组与阴性对照组(t=14.214，P=0.000)和对照组(t=14.378，P=0.000)比较，均具有极显著差异，阴性对照组与对照组比较(t=1.635，P=0.133)没有统计学意义。 (3)实验组、阴性对照组及对照组裸小鼠皮下种植瘤平均体积1367.2±665.2、3011.4±966.8和3108.6±1006.3mm3，试验组、阴性对照组及对照组裸小鼠皮下种植瘤平均重量分别为1.24±0.86g、2.57±1.43g和2.66±1.65g，按体积和重量计算，与对照组和阴性对照组相比，实验组裸小鼠皮下种植瘤抑瘤率分别为56.0％和3.1％以及54.4％和3.4％。实验组COX-2mRNA表达明显降低，有很好的基因敲除效果，与对照组和阴性对照组相比干扰效果分别达到67.8％和66.4％。与对照组比较，阴性对照组COX-2蛋白和ki-67蛋白均无明显变化，实验组COX-2蛋白和ki-67蛋白抑制率分别为56.7％和51.8％。 结论(1)靶向COX-2的RNA干扰能有效抑制胃癌SGC7901细胞中COX-2基因和蛋白表达。 (2)靶向COX-2的RNA干扰能有效抑制胃癌SGC7901细胞生长，促进胃癌细胞凋亡，并有效抑制胃癌SGC7901细胞皮下种植瘤的生长。 (3)因为COX-2在恶性肿瘤发生发展中从多方面发生作用，并且与胃癌的复发转移等多方面病理因素密切相关，因此靶向COX-2的RNA干扰在胃癌复发和转移过程中可能起到多方面治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

引 言

第一部分COX-2、Ki-67及MVD在胃癌组织中的表达及其与胃癌肝转移及胃癌复发关系的研究

第二部分RNA干扰靶向抑制胃癌SGC-7901细胞COX-2基因和蛋白表达方法的建立

第三部分靶向COX-2的RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞和裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用

总 结

参考文献

缩写词及中英文对照表

综述 RNA干扰恶性肿瘤治疗

博士期间发表论文情况

致 谢

原创作声明