miRNA干扰SGC-7901胃癌细胞株PRL-3表达抑制胃癌腹膜转移的临床和实验研究

摘要

第一部分PRL-3在胃癌组织中的表达及其与胃癌腹膜转移的关系的研究 目的：检测促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)蛋白在胃癌中的表达，探讨其与胃癌的侵袭转移及预后的关系。 方法：采用免疫组化的方法检测121例胃癌原发灶，95例淋巴结转移灶及25例腹膜转移灶PRL-3的表达，分析其表达水平与病理临床资料的关系及其对胃癌预后的影响。 结果：PRL-3在胃癌原发灶的表达阳性率为71.9﹪，其中伴淋巴结转移的原发灶的表达率(77.9﹪)明显高于无淋巴结转移的原发灶(50.0﹪)，两者有显著性差异(P=0.005)；淋巴结转移灶的PRL-3的表达明显高于原发灶(P=0.009)。 另外，PRL-3的表达与胃癌的淋巴管侵犯、淋巴结转移程度、TNM分期密切相关，并且与患者的预后呈负相关。在25例胃癌伴腹膜转移患者中原发灶PRL-3表达的阴性、弱阳性和强阳性的表达分别为6、13和6例，而其相应的腹膜转移灶分别为3、6和16例(P<0.05)。 结论： 1．PRL-3与胃癌的浸润转移密切相关，并且与患者的预后呈负相关。 2．PRL-3可能在胃癌腹膜转移中起促进作用。 第二部分miRNA干扰抑制胃癌SGC-7901细胞PRL-3基因和蛋白表达方法的建立 目的：通过以鼠miR-155为骨架构建针对PRL-3基因的特异性miR RNAi载体，建立有效的RNA干扰方法。并进一步筛选稳定的PRL-3干扰效果的SGC7901细胞克隆，为进一步的功能实验奠定基础。 方法:利用invitrogen的在线RNAi设计工具，设计了三条针对PRL-3的特异性的干扰序列。将选择的序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行BLAST序列比对，确信所选择的序列与其他的基因不具有同源性。构建以鼠miR-155为骨架构建针对PRL-3基因的特异性miR RNAi载体，通过用脂质体lipofectamine2000分别将特异性miR RNAi载体pCMV-PRL3miRNA-29，pCMV-PRL3miRNA-477、pCMV-PRL3miRNA-1249 和阴性对照pCMV-PRL3miRNA·neg转染入胃癌SGC7901细胞，48小时后用RT-PCR和Western blot检测PRL-3的mRNA和蛋白的表达变化情况，并确定干扰效果最佳的序列。用含6μg/ml Blasticidin培养液经过约60天选择培养获得针对PRL-3基因的特异性miR RNAi载体的稳定转染SGC7901细胞，并在mRNA和蛋白水平证实其干扰效果。 结果： 1 ) 经过PCR扩增后测序鉴定pCMV-PRL3miRNA-29、pCMV-PRL3miRNA-477和pCMV-PRL3miRNA-1249构建正确，序列无突变。 2) 通过用脂质体lipofectamine2000分别将特异性miR RNAi载体和阴性对照载体转染入胃癌SGC7901细胞。48小时后，在pCMV-PRL3miRNA-477和pCMV-PRL3miRNA．1249表达载体组PRL-3 mRNA的表达量与对照的SGC7901组相比减少超过80﹪(P<0.05)；pCMV-PRL3miRNA-477和pCMV-PRL3miRNA-1249表达载体组PRL-3蛋白表达量比SGC7901对照组分别减少73.0﹪(P<0.05)和78.7﹪(P<0.05)。在各组之间内参β-actin没有明显的变化，在三种构建的PRL-3 miR RNAi表达质粒中，pCMV-PRL3miRNA-1249组RNAi效果最好。 3) 筛选出稳定转染pCMV-PRL3miRNA-1249 和pCMV-PRL3miRNA-neg质粒的SGC7901细胞克隆。Western blot检测表明pCMV-PRL3miRNA-1249-A1 、pCMV—PRL3miRNA-1249-A2 和pCMV-PRL3miRNA-1249-A3三个细胞克隆的PRL-3的蛋白表达量分别比对照SGC7901细胞下降66.7﹪、79.8﹪和78.7﹪(P<0.05)；同样在mRNA水平，转染pCMV-PRL3miRNA-1249的SGC7901细胞克隆(A1、A2、A3)的mRNA表达比对照的SGC7901细胞下降约80﹪(P<0.05)。结论1．成功构建三个PRL-3 miR RNAi表达质粒。 2．以鼠miR-155为骨架合成的针对PRL-3特异性的miRNA对PRL-3有明显的RNAi作用，其中pCMV-PRL3miRNA-1249表达质粒的干扰效果最好。 3．本实验筛选出了一个稳定转染pCMV-PRL3miRNA-1249质粒的SGC7901细胞克隆(pCMV-PRL3miRNA-1249-A2)，为PRL-3基因功能的进一步研究奠定了基础。 第三部分靶向PRL-3的RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞腹膜转移的体内外抑制作用 目的：观察PRL-3基因RNA干扰对SGC7901细胞腹膜转移的体内外抑制作用，探讨PRL-3与胃癌腹膜转移的关系，为基因治疗提供一定了理论依据。 方法：在体外通过细胞划痕实验观察PRL-3基因RNA干扰对SGC7901细胞运动功能的影响；通过Transwell侵袭实验观察对细胞侵袭能力的影响。在体内，通过裸鼠腹膜种植模型观察PRL-3基因RNA干扰对SGC7901细胞腹膜转移的影响。 结果：1．细胞划痕实验表明，划痕后培养24小时pCMV-PRL3miRNA-1294-A2组迁移细胞数为5±1.6个细胞/mm<'2>，而正常SGC7901对照组和pCMV-PRL3miRNA-neg-A1阴性对照组的迁移细胞数分别为23±2.6个细胞/mm<'2>和20.8±1.9个细胞/mm<'2>，PRL-3干扰组细胞随意运动能力明显降低(P<0.05)。 2．Transwell侵袭实验发现细胞接种后24小时各组细胞穿透Matrigel胶迁移到Transwell膜背面的细胞数分别为：SGC7901组，109±23/HP：pCMV-PRL3miRNA-neg-A1组，112±15/HP；pCMV-PRL3miRNA-1294-A2组，32±10/HP。pCMV-PRL3miRNA-1294-A2组的侵袭细胞数明显低于其他两组(P<0.05)，说明抑制PRL-3的表达可以降低SGC7901细胞的侵袭能力。 3．体内裸鼠腹膜模型表明细胞接种3周SGC7901组和pCMV-PRL3miRNA-neg-A1组腹膜转移灶分别为107±23.5个和110±27.6个，而PRL-3干扰组为37±7.3个转移灶，显著的少于其他两组(P<0.05)。另外，PRL-3干扰组(pCMV-PRL3miRNA-1294-A2)的生存时间明显长于正常细胞组和阴性对照组。 结论: 1．RNA干扰PRL-3基因表达可以抑制SGC7901胃癌细胞体外运动和侵袭转移的能力。 2．RNA干扰PRL-3基因表达可以抑制SGC7901胃癌细胞体内腹膜转移，且延长腹膜转移裸鼠的生存时间。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分PRL-3在胃癌组织中的表达及其与胃癌腹膜转移的关系的研究

实验材料和方法

结 果

讨论

结论

附图1

第二部分miRNA干扰靶向抑制胃癌SGC-7901细胞PRL-3基因和蛋白表达方法的建立

实验材料和方法

结果

讨 论

结 论

附图2

第三部分靶向PRL-3的RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞腹膜转移的体内外抑制作用

实验材料和方法

结果

讨论

结论

附图3

总结与创新

展望

参考文献

缩略词

附录部分

综述一 胃癌腹膜转移的治疗进展

综述二 肝再生磷酸酶与肿瘤转移的研究进展

在读期间发表的论文：

致谢

原创性声明