铂类和氟化嘧啶类药物对宫颈癌细胞株裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究

摘要

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一。随着化疗药物的不断开发及给药途径和方法的改进，近10年来宫颈癌的化疗取得了一定的疗效。 顺铂是治疗宫颈癌应用最广和比较有效的药物，以顺铂为基础的联合化疗已成为目前局部晚期(FIGOⅠb2期及以上)宫颈癌综合治疗方案中的标准化疗方案。不同的联合方案仍然处在研究中。 顺铂具有化学治疗和放射增敏的双重作用，但其肾毒性限制了其临床应用。 卡铂是第二代铂类药物。1989年被美国FDA批准上市。临床试验表明，对顺铂有效的肿瘤，使用卡铂同样有效，且对肾脏的毒性较小。 5-FU也是一个比较公认的治疗宫颈癌有效的药物。以往的研究表明用5-FU治疗宫颈癌的有效率为20％。但由于其药物剂量大，浓度高，输液时间长，外周静脉炎的发生率较高，据报道可达83.3％。因此，有必要寻找使用方便的新剂型。 卡培他滨(商品名：XELODA希罗达)是一种对肿瘤细胞有选择性活性的口服细胞毒制剂，本身无细胞毒性，但在体内可转化为具有细胞毒性的5-FU。由于卡培他滨为口服片剂，就可以建立一个口服药物的家庭治疗方案，极大的方便了患者。 本课题组已完成铂类药物在SiHa和HeLa两种细胞株及SiHa宫颈癌移植瘤裸鼠模型中对TP调节的研究，结果表明，顺铂和卡铂对TP均有明显的上调作用，因此，有必要研究铂类与嘧啶类药物应用时TP的表达情况，从而进一步探讨两者联合应用时抗肿瘤的分子机制。 本实验通过建立宫颈癌的移植瘤模型，用不同的化疗药物处理，从大体标本和分子生物学水平这两个方面来评价临床常用的铂类和嘧啶类药物对宫颈癌的抑制和(或)治疗作用，为寻找更有效、低毒、使用方便的宫颈癌的化疗药物提供动物实验的依据。 材料和方法:1、建立裸鼠移植瘤模型对数生长期的HeLa细胞，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，台盼蓝染色法观察活细胞＞95％后调整浓度，使肿瘤细胞的终浓度为5×107/ml。将细胞悬液接种于4-6周龄的BALB/c-nu/nu裸雌性小鼠(体重16-20g)右侧背部皮下，每只0.2ml，于恒温(25-27℃)、恒湿(25-50％)、新鲜空气高度除菌、无特殊病原体(SPF)环境下饲养。摄入的水及食物均灭菌处理。 2、分组及用药方案皮下接种10天左右，肿瘤直径约0.5cm(体积为28.04-41.56mm3)大小(经统计学分析表明各组体积间无统计学差异)，按随机化的原则分为8个组，即A：对照组、B1：顺铂组、B2：卡铂组、B3：5-FU组、B4：卡培他滨组、B5：：顺铂+5-FU组、B6：：顺铂+卡培他滨组、B7：卡铂+5-FU组。每组6-8只。用药剂量参考相关的文献，具体如下：对照组：包含5％阿拉伯胶的柠檬酸缓冲液灌胃qd×14天，顺铂：8mg/kgi.p(腹腔注射)顺铂+卡培他滨组、B7：卡铂+5-FU组。每组6-8只。用药剂量参考相关的文献，具体如下：对照组：包含5％阿拉伯胶的柠檬酸缓冲液灌胃qd×14天，顺铂：8mg/kgi.p(腹腔注射)×第1天，卡铂：60mg/kgi.p×第1天，5-FU：20mg/kgi.pqd×6天，卡培他滨：359mg/kg，p.o(灌胃)第1天-第14天(卡培他滨用包含5％阿拉伯胶的柠檬酸缓冲液溶解)。 3、裸鼠观察(1)给药后每隔四天用游标卡尺经皮测量肿瘤的最长径(A)、最短径(B)，按公式V=1/2AB2(V=肿瘤近似体积，A=瘤体的最长径，B=瘤体的最短径)计算肿瘤体积，并绘制生长曲线。 (2)首次给药后22天，采用摘眼球法取血处死裸鼠，用电子天平称量瘤重，按公式：抑瘤率=(对照组平均瘤重-处理组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％，计算抑瘤率。 (3)取血检测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、谷-丙转氨酶(ALT)、谷-草转氨酶(AST)。 4、免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)，评价药物对移植瘤的增殖的影响以细胞核内出现明确棕色颗粒为PCNA阳性细胞，结果用全自动图像分析系统进行分析。用阳性单位(positiveunit，PU)定量表达免疫组织化学的显色反应程度。 5、DNA切口末端标记法(TUNEL)检测药物对移植瘤细胞凋亡的影响以细胞核内出现明确蓝色颗粒为凋亡阳性细胞，结果用凋亡指数(ApoptoticIndex，AI)表示。AI=调亡细胞数/总细胞数×100。 6、RT-PCR法检测各组TPmRNA的表达用TP/β-actin进行半定量，结果用Uvitec凝胶图像扫描分析软件对PCR扩增产物的电泳结果进行摄像、分析。 结果:1、肿瘤体积的变化用首次给药后第22天肿瘤的体积(V22)及体积的改变(dV=第22天的体积-第一天的体积)这两项指标来评价药物对肿瘤的抑制作用。本实验中各组移植瘤体积的变化是：B6＜B5＜B7＜B4＜B2＜B1＜A，各处理组都能抑制肿瘤的生长，与对照组比较，均有统计学意义，P＜0.05。其中，在V22与dV中，B5、B6、B7的值明显小于B3，在dV这项指标中，B6的值明显小于B1，单因素分析表明B5/B6/B7与B3，B6与B1之间均有统计学差异，P＜0.05，但是多因素析因分析未能显示出联合用药组各药物之间存在正交互效应。其他实验组之间没有显著性差别。 2、瘤重的比较本实验中，各组的瘤重情况是：B6＜B5＜B7＜B2＜B1＜B4＜B3＜A，B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7抑瘤率分别是：47.59％、56.83％、27.36％、34.63％、72.64％、80.00％、59.10％。B1、B2、B5、B6、B7的瘤重明显小于对照组，差异存在统计学意义，P＜0.05。其中，B5、B6的瘤重均小于B3，经统计学分析，B5与B3、B6与B3之间也存在统计学意义，P＜0.05，但是，析因分析未能显示出他们之间存在正交互效应。其他实验组之间没有显著性差别。 3、不同化疗药物对移植瘤PCNA的影响本实验中，B1、B2、B3、B5、B6、B7的PU值均小于对照组(15.70±2.76)，它们分别与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05。B6的PU值小于B1、B4、B5，经统计学分析，B6与B1/B4/B5之间也存在统计学意义，P＜0.05，但是，析因分析未能显示出他们之间存在正交互效应。其他实验组之间没有显著性差别。 4、不同化疗药物对移植瘤AI的影响本实验中，B7的AI值明显大于A、B2、B3组，经统计学分析，B7与A/B2/B3之间均存在统计学意义，P＜0.05。但是，析因分析未能显示出他们之间存在正交互效应。其他实验组之间没有显著性差别。 5、不同化疗药物对移植瘤AI/PU的影响本实验中，B7、B5、B2的AI/PU均大于对照组，AI/PU为0.35±0.13)，经统计学分析，B7/B5/B2与A之间均存在统计学意义，P＜0.05。B7的AI/PU显著性的大于B1，它们之间的差异有统计学意义，P＜0.05。B7的AI/PU显著性的大于B6，它们之间的差异也有统计学意义，P＜0.05。其他实验组之间没有显著性差别。 6、不同化疗药物对移植瘤TPmRNA的影响本实验中，B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7的TPmRNA水平分别为A的11.5倍、10.5倍、2.0倍、2.5倍、1.5倍、3.0倍和1.5倍，经统计学分析，B1与A、B2与A之间的差异有显著性，P＜0.05。B3、B4的TPmRNA水平低于B1，B6、B7低于B2，B3/B4与B1，B6/B7与B2之间的差异也存在统计学意义，P＜0.05。其他实验组之间没有显著性差别。 7、药物对移植瘤裸鼠体重的影响本实验中，用首次给药的第一天的体重(M1)、实验结束点的体重(M22)和体重的变化(dM)来表示各药物组对裸鼠体重的影响。各组的M1均无统计学差异。B4、B7的体重呈负增长，在dW上，B7与A/B1/B3/B5/B6之间存在统计学意义，P＜0.05。其他各组之间不存在统计学意义。 8、移植瘤裸鼠的血液学和肝肾功能改变虽然B2对WBC、Hb的抑制作用大于B1，经统计学分析有显著性差异，但是B1、B2的WBC、Hb值均在正常范围，而且B2与A之间无统计学差异。B5、B6的RBC计数小于B1，差异有统计学差异，B7的RBC计数小于B2，它们之间的差异也有统计学意义。在PLT方面，B3大于B7，其差异存在统计学意义。从而提示卡铂对血液学的影响大于顺铂，联合用药组对血液学的影响大于单药组。B1、B2的BUN分别为：15.96±5.15mmol/l、9.24±3.78mmol/l，单因素方差分析表明两者间存在统计学差异，P＜0.05，提示顺铂对肾功能的影响大于卡铂。在ALT、AST方面，各组之间均不存在统计学上的差异，其他实验组之间没有显著性差别。 结论:1、卡铂和顺铂对治疗裸鼠宫颈癌移植瘤的作用相当，但是顺铂的肾毒性大于卡铂，而卡铂的骨髓抑制作用在可接受的正常范围之内。 2、卡培他滨和5-FU对裸鼠宫颈癌移植瘤的治疗作用无显著性差异，但卡培他滨是口服制剂，给药更方便。 3、联合用药时各药物之间的抗肿瘤作用并没有相互增强而只是药效的相加。 4、顺铂、卡铂均能上调TPmRNA水平，其上调TPmRNA水平的作用相当。联合5-FU或卡培他滨的单药及联合药物组中，其TPmRNA水平上升不明显。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

局限性及展望

结论

参考文献

英文缩写词

附图

致谢

原创性声明