铂类联合抗嘧啶类药物序贯疗法在宫颈癌治疗中的实验研究

摘要

化学治疗已经成为宫颈癌的综合治疗的方法之一。Meta分析[1]结果表明：与手术后放疗比，化疗后再手术治疗是宫颈癌有效的治疗模式，5年生存率提高7％~14％。抗嘧啶类药物是各种进展期癌症治疗中的重要化疗药物[2]。国际妇产科联盟(FIGO)2003年推荐宫颈癌使用顺铂(75mg/m2)加氟尿嘧啶(4000mg/m2，静脉滴注>96h)为宫颈癌患者的化疗方案。美国国家癌症研究所推荐此方案为宫颈鳞癌的标准治疗方案。该方案中顺铂的毒副作用限制了它的应用，5-FU也存在生物利用度低、应用不方便等缺点。有必要寻找新的疗效确实、毒副反应较小、用药方便的化疗药物和化疗方案。 卡铂作为第二代铂类药物，剂量限制性的毒副作用显著减少，可以根据患者肾功能个体化用药，卡培他滨是口服的5-FU前体药物，具有选择性的细胞毒作用，能够模拟持续输注5-FU的作用。胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase，TP)不仅是卡培他滨选择性发挥细胞毒作用的关键酶，还能催化5-FU向其活性代谢产物氟尿嘧啶脱氧核苷酸转化，提高患者对抗嘧啶类药物的敏感性。应用抗嘧啶类药物时，胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase，TP)高的患者术后平均生存时间长。TP的表达可决定肿瘤对抗嘧啶类药物的化疗敏感性，是卡培他滨(capecitabine，CAP)化疗的预后预测标记物[3]。 本课题组已有研究表明卡铂与DFUR(卡培他滨的水化制剂)联合的细胞抑制作用比顺铂与DFUR联合强，但均弱于顺铂联合5-FU。顺铂和卡铂对宫颈癌SiHa细胞株的TP表达均有上调作用，但是SiHa细胞在铂类药物作用后TP上调怎样变化?TP升高后再加用抗嘧啶类药物，是否会取得更好的化疗效果?可否利用TP的变化寻找更好疗效的序贯化疗方案?这些问题值得进一步探讨。 本研究通过体外培养宫颈癌SiHa细胞株，研究顺铂、卡铂上调TP的变化情况、比较二者的异同：并利用这个变化研究联合5-FU、OFUR序贯化疗方案对宫颈癌细胞株抑制作用的影响，期望寻找疗效确切、用药方便、毒性较低的宫颈癌辅助化疗方案。 研究方法： 1.细胞培养和药物处理 SiHa细胞株应用RPMI1640培养基，置于含5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养。实验分组为：对照组、顺铂组、卡铂组共3组。根据本课题组已有结论选择药物作用72小时的IC50，顺铂和卡铂分别是：19uM，236.82uM；DMSO的浓度控制在0.5％。 2.RT-PCR检测顺铂和卡铂对宫颈癌细胞株TPmRNA表达的影响 各组细胞分别于药物作用后0，4，8，12，16，24，36，48小时检测TPmRNA表达。 3.Westernblot检测顺铂和卡铂对宫颈癌细胞株TP蛋白表达的影响 各组细胞分别于药物作用后0，6，12，18，24，30小时检测TP蛋白表达。 4.MTT法检测顺铂和卡铂上调TP后5-Fu、DFUR序贯用药细胞的增殖抑制情况 分9组：空白对照组，顺铂+5-FU对照组(DF组，同时加药组)、顺铂+5-FU实验组(DF’组，先加顺铂，TP峰值时加5-FU，即序贯方案组)，卡铂+5-Fu对照组(CF组)、卡铂+5-FU实验组(CF’组)，顺铂+DFUR对照组(DD组)、顺铂+DFUR实验组(DD’组)，卡铂+DFUR对照组(CD组)、卡铂+DFUR实验组(CD’组)。 顺铂、卡铂均选用药物作用72小时的IC50，5-FU，DFUR参考临床最大峰值血药浓度各选取八个实验浓度。 以5×103个细胞/孔接种于96孔培养板，24h后，除空白对照组外，其他对照组同时加入铂类和抗嘧啶类药物(根据上述分组加5-Fu或者DFUR八个递减浓度组)，实验组只加入相应铂类药物，培养24小时后，全部弃旧培养基，实验组加入含相应递减浓度的抗嘧啶类药物，余组别加入不含药物之新鲜培养基，再次培养24小时之后，MTT法在酶标仪上测定OD595。 5.流式细胞仪检测药物对宫颈癌细胞株凋亡的影响(FITC/PI双标记试剂盒) 分9组，同4。药物浓度选择：5-FU、DFUR、顺铂、卡铂均选用药物作用72小时的IC50。DMSO浓度控制在0.5％。用6孔板，接种24h后，除空白对照组外，其他对照组同时加入铂类和抗嘧啶类药物，实验组只加入相应铂类药物，培养24小时后，全部弃旧培养基，实验组加入含相应抗嘧啶类药物，余组别加入不含药物之新鲜培养基，再次培养24小时之后收集细胞按FITC/PI双标记试剂盒说明检测各组细胞凋亡率。 结果： 1.顺铂和卡铂对宫颈癌细胞株TPmRNA及蛋白表达的影响顺铂和卡铂作用4～8小时后TPmRNA表达开始增加，24小时达高值，相对于空白组，顺铂组升高2.52倍，卡铂组升高1.90倍，24小时后渐降低，顺铂和卡铂作用6～12小时后TP蛋白增加，24小时达高峰，顺铂组和卡铂组表达分别是对照组的3.45倍和2.73倍。蛋白质增加幅度大于mRNA，顺铂组与卡铂组间差异无统计学意义。 2.5-FU、DFUR在与顺铂、卡铂联合用药时序贯化疗对宫颈癌细胞株细胞增殖抑制的影响在TP升高后抗嘧啶类药物作用24小时MTT检测结果：实验组相对于对照组全部增殖明显，所有实验组的IC50全部较对照组升高，相比于联合5-FU的组别，联合DFUR组别的实验组和对照组差别较小。 3.5-FU、DFUR在与顺铂、卡铂联合用药时序贯化疗对宫颈癌细胞株凋亡的影响实验组凋亡率均较相应对照组要高，方差分析仅卡铂+OFUR实验组与对照组有统计学意义的；4个实验组之间比较，联合DFUR的组别凋亡率绝对值均高，但均无统计学意义；联合DFUR的实验组凋亡率高于传统化疗方案对应的DF，CF组，与DF组的差别有统计学意义。 结论： 1.顺铂和卡铂可以上调宫颈癌SiHa细胞株TP，渐次升高后下降，呈时间依赖性，顺铂组与卡铂组上调TP的作用差异不显著。 2.铂类联合DFUR/5-FU序贯化疗方案中，TP升高后可以增加抗嘧啶类药物促凋亡能力，DFUR表现更明显。 3.卡铂联合抗嘧啶前体类药物序贯化疗方案值得进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

结 果

1.顺铂和卡铂对宫颈癌细胞株TP mRNA及蛋白水平的影响

2.序贯化疗中FU、DFUR对宫颈癌细胞株细胞增殖抑制的影响

3.药物对宫颈癌细胞株凋亡的影响

讨 论

进一步研究方向和展望

结 论

参考文献

附 图

致谢