cAD杂合肽基因在毕赤酵母中的表达及活性的检测

摘要

天蚕素(Cecropins)是昆虫抗菌肽(antibacterialpeptide)的一种，是最早被发现的一类抗菌肽，由31～39个氨基酸残基组成，分子量约为4KDa左右，等电点约为8.9～9.5，表现出较强的阳离子特征；不含半胱氨酸(Cys)，不能形成分子内二硫桥，抗菌谱主要包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，对病毒、肿瘤细胞、原虫、真菌也有一定的抑制作用。而且耐高温，100℃加热仍能保持一定的活性。 本研究根据家蝇(Muscadomestica)成熟肽CecropinA和惜古比天蚕(Hyalophoracecropoa)成熟肽CecropinD的氨基酸序列，构建了杂和肽cAD，运用生物学软件DNAStar对其轮状结构进行预测，结果显示cAD的N末端具有较强的亲水性，C末端具有较强的疏水性，预测cAD具有较强的杀菌活性。通过选用毕赤酵母偏爱密码子，合成了cAD的4个片断，两两重叠互补20个碱基，为便于纯化表达的cAD，在cAD的C末端加入了6×His-tag，循环式PCR扩增得到了cAD的全序列。克隆到毕赤酵母pPIC9表达载体上。构建了酵母分泌型表达载体pPIC9-cAD，用SacI线性化后，电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115宿主菌，经MM板和MD板进行表型筛选结果90％以上为His+Muts，经PCR鉴定目的基因已稳定整合到毕赤酵母基因组上。对PCR鉴定正确的阳性克隆用甲醇诱导表达后，经Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳检测表明，表达产物为5.1KDa，与软件分析的一致，表明cAD在信号肽α-factor的介导下，正确分泌到表达上清中。利用琼脂孔穴平板扩散法，杀菌效价等方法测定其活性，结果证明cAD杂合肽基因在酵母中得到表达，表达产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、和非溶血性弧菌等具有一定的活性。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第二章 昆虫抗菌肽的研究进展

第三章材料与方法

第四章结果与分析

第五章讨论

第六章结论与展望

参考文献

缩略词

致谢

原创性声明