广东省食品中单增李斯特菌的污染状况及其PFGE分子分型研究

摘要

食品是人类赖以生存和发展的物质基础。近年来，在世界范围内食品安全方面的恶性和突发事件屡屡发生。李斯特菌病已成为全球性食源性疾病之一，在国际上受到高度重视。因此，对该病的病原学研究十分重要。 研究目的 1.从食物种类、时间、地点三个方面分析广东省有代表性的食品中单增李斯特菌的污染状况及其流行趋势。 2.应用PFGE对单增李斯特菌进行分子分型，分析广东省有代表性的食品中单增李斯特菌的分子流行病学特征。 3.建立食品中单增李斯特菌的PFGE数据库。 研究方法 1.单增李斯特菌的检验 1.1样品来源 1.1.1采样时间：在2002年至2005年四年期间，根据广东省的特殊气候，每个采样点分春冬和夏秋各采样一次。 1.1.2采样地点：为了使采集的样品达到较好的均衡性和全面性，在地理分布上兼顾了全省的东南西北部，选取地点有山区、平原和沿海地区，既有经济发达的地区，也有经济相对落后的地区，这样采集的样品能真实地反映广东省食品的污染情况。选取的地点有韶关(包括仁化和始兴)、湛江、深圳、广州(包括增城和番禺)、汕头(澄海)和海丰；从2004年开始增加了肇庆、东莞、珠海、江门和中山共11个监测点。 1.1.3样品种类和数量：采集的食品有生肉(鸡、猪、牛和羊)，无定型包装熟肉、生牛奶、酸奶、冰淇淋、水产品和蔬菜，每年检测样品400～600份。后来增加的5个监测点由地方疾病预防控制中心每年采样并检测80份样品，阳性菌株上送广东省疾病预防控制中心。 1.2检验方法： 参照全国食源性致病菌检测工作手册和GB／T 4789.30-2003《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》方法进行检测，获得阳性菌株，并保存菌种。 1.3数据分析： 应用统计软件SPSS11.0进行数据分析及绘制统计图。 2．单增李斯特菌PFGE分子分型方法的建立 2.1 PFGE原理： 将细菌包埋于琼脂凝胶块中，用溶菌酶和蛋白酶K将细菌菌体和蛋白质消化，释放出完整的细菌染色体DNA，再用适当的限制性内切酶在原位对整个细菌染色体DNA进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。 2.2 PFGE方法： 参照美国PulseNet的单增李斯特菌PFGE分子分型标准方法进行检测，并根据实际情况进行实验条件的优化。 2.3数据分析： 采用比利时Applid Maths公司的BioNumerics关系数据库软件进行图像分析，建立数据库，进行比对和相应分析。 研究结果 1.广东省有代表性的食品中单增李斯特菌的污染状况 本研究从2002年-2005年一共检测了2100份食品，其中有90份样品检出单增李斯特菌，阳性率为4.29％。按检出单增李斯特菌阳性率由高到低排列：生鸡肉为7.90％、生羊肉为7.46％、熟肉制品为7.21％、生牛肉为4.17％、生猪肉为3.42％、水产品为3.18％、色拉为2.61％、蔬菜为1.28％、冰淇淋和生牛奶为0。 广东省的气候比较特殊，每年7-9月是广东省最热的季节，但检出率却最低为3.58％，1-3月是广东省最冷的季节，检出率却最高为11.21％。2002年-2005年检出率分别为1.57％、3.77％、8.68％和3.16％，检出率从2002年逐年上升至2004年达高峰，2005年回落。 2002年-2005年韶关检出单增李斯特菌阳性率最高为9.22％，依次为汕头5.43％、深圳5.03％、广州4.67％、湛江1.95％。 2．PFGE方法建立与实验条件优化 根据PFGE实验条件优化结果，把细菌菌悬液的浊度调整为0.85-0.90，比标准方法的0.79-0.82要高，因为菌含量越高，DNA的含量也会越高，电泳出来的图谱DNA的亮度也会相应变强。由于细胞裂解2小时的DNA图谱比细胞裂解3小时的图谱缺失了分子量最大的1条DNA片段，故把细胞裂解时间2小时改为3小时。对于21cm×14cm的胶，电泳时间21小时会使H9812最小分子量的DNA片段跑到胶的底部，超出要求范围(距胶的边缘1.0-1.5am)之外，故把电泳时间从21小时改为20小时。其余条件不变。 3．应用PFGE方法，分析广东省有代表性的食品中单增李斯特菌的分子流行病学特征 食物种类、采样时间和采样地点相同，单增李斯特菌出现相同的PFGE图谱，并且相似值为100％，为同一基因分型，说明这些分离株具有极高的同源性。 若食物种类、采样时间和采样地点都不相同，单增李斯特菌出现相同的PFGE图谱，为同一基因分型，说明这些分离株亲缘关系很近。 韶关(仁化、始兴)、惠州、汕头(澄海)和湛江各自有本地区特有的PFGE图谱，提示为有本地区特有的分离株。广州(番禺、增城)、深圳、中山、肇庆和珠海没有本地区特有的PFGE图谱，佛山、海丰和揭阳各检出1株单增李斯特菌，各自独立分为1个型。 4．单增李斯特菌PFGE数据库的建立 应用PFGE方法对107株(其中90株为本实验室监测所得，17株为地方疾病预防控制中心上送菌株)分离自广东省食品中的单增李斯特菌进行分子分型，用AscI限制性内切酶进行酶切，可产生8-14条DNA片段，分子量大小在20kb—1100kb之间。用BioNtimerics V4.0软件对数据进行聚类分析，根据电泳产生条带的位置和数量的不同，共分为41个不同的型别，相似值在54.4％-100％。这些实验菌株表现出较大的遗传多样性。 结论 1.广东省食品存在单增李斯特菌的污染，2002年-2005年单增李斯特菌的阳性率为4.29％。在生鸡肉、生羊肉、生牛肉、生猪肉、熟肉制品、水产品、色拉和蔬菜等大多数食品中均可检出该菌。检出率从2002年开始逐年上升，至2004年达高峰，2005年回落。其中韶关地区食品中单增李斯特菌的阳性率最高，表明边远山区单增李斯特菌污染食品的机会较多。 2.首次应用PFGE方法对107株分离自广东省食品中的单增李斯特菌进行分子分型，共分为41个不同的型别，这些实验菌株在整体上表现出较大的遗传多样性，但部分菌株存在着不同程度的亲缘关系。基因分型与食物种类没有相关性。韶关、惠州、汕头、湛江有本地区特有的PFGE图谱，基因分型存在地区同源性。在2002年-2005年四年期间，不同分离株之间出现变异现象，但仍有高度同源性。 3．在研究单增李斯特菌不同菌株之间的分子流行病学关系方面，脉冲场凝胶电泳是一种有效的方法，可以揭示不同分离株之间的亲缘关系。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章广东省食品中单增李斯特菌污染状况的研究

第3章广东省食品中单增李斯特菌PFGE分子分型的研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第4章结论

参考文献

综述单核细胞增生李斯特菌及李斯特菌病的研究进展

附录

致谢

原创性声明