G6PD/6PGD比值法实验条件优化的探讨和深圳地区居民G6PD基因突变型及其表达的研究

摘要

G-6-PD缺乏症是一组累及全球约4亿人的遗传性溶血性疾病。也是中国南方高发的一种遗传病。G-6-PD缺乏症能致许多疾病，如某些药物或食物引起的急性溶血性贫血，严重的慢性非球形红细胞溶血性贫血，新生儿黄疸等。及时的产前诊断和正确的治疗可以有效地预舫新生儿黄疸，该病已被母婴保护法列为产前筛查的常规疾病之一。 G6PD缺乏症的筛查目前主要应用生化方法。Lyon假说认为，携带突变的女性杂合子其表型有可能是正常的，这形成了女性杂合子表型的复杂性，容易产生假阴性。 很多生化方法对女性杂合子检出率不高。国内知名学者杜传书教授在此领域做了大量研究工作并在20世纪80年代推荐用G6PD／6PGD比值法，由于该方法比以往的生化试验有更高的检出率，因此，我国南方大部分地区至今都在应用该方法。但如何能更好地提高对女性杂合子的检出率，仍是广大医学工作者所关心的问题。随着基因检测方法的不断成熟及应用，使我们有可能直接把女性杂合子人群作为研究对象，再反过来研究并优化G6PD／6PGD比值法的试验条件，使其能更好地提高对女性杂合子的检出率。本研究的第一部分是以我国常见的G6PD三种基因突变型即G1388A，G1376T，A95G女性杂合子为研究对象，以经基因检测确诊为G6PD基因突变的女性杂合子为“金标准”，在保留原G6PD／6PGD比值法试验主要优点的基础上来研究G6PD／6PGD比值法的影响因素，经过统计分析找出G6PD／6PGD比值法的最佳工作条件，即在孵育温度37℃，底物终浓度为0.78mmol／L G6PNaz和0.195mmol／L NADP><'+>时，其最佳工作点为10分钟． G6PD缺乏症的根本原因是基因突变的结果。至今，全世界报导的G6PD基因突变型已超过150种，中国人的基因突变型已有21种。我们已经知道，一些G6PD突变型与临床分型有一定的相关性，因此G6PD基因型的检测对相关疾病的临床诊断和预防具有重要意义。我们利用聚合酶链反应结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法和测序技术，确定本地居民G6PD基因突变型。我们发现G1376T，G1388A是深圳本地居民最常见的基因突变型。我们通过改良的荧光定量PCR法，检测了G1376T，G1388A及正常人群的mRNA含量且用G6PD/6PGD比值法检测了G1376T，G1388A两类人群的G6PD酶活性。男性G1388A者的mRNA量与男性G1376T者的mRNA的量有显著差异，前者明显高于后者(P<0.05)。男性G1388A突变经G6PD/6PGD比值法测得的酶活性与男性G1376T有显著差异，男性G1376T明显低于男性G1388A者的酶活性(P<0.01)。 通过对本地区居民G6PD基因突变型确定、mRNA的定量和G6PD/6PGD比值法所测得的酶活性进行系统的分析，为人类基因组多样性研究增加了中国人的遗传数据，对本地G6PD缺乏症的预防和治疗有重要的指导意义。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章实验材料

第二章实验方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附录

致谢

原创性声明