人表皮干细胞及眼睑鳞癌肿瘤干细胞生物学特性的研究

摘要

胚胎的分化发育研究显示人体内存在干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。这种细胞的存在，使得在遗传性或严重外伤性疾病中人体器官或组织的再生成为可能。现阶段研究表明人表皮干细胞(Epidermal stem cells，ESC)主要存在于皮肤毛囊外根鞘和表皮基底细胞层中。 近年来，随着正常干细胞研究理论的深入和研究技术的发展，许多学者提出肿瘤干细胞(Tumor stem cells，TSC)的概念，认为肿瘤是由肿瘤干细胞增殖分化形成，而肿瘤干细胞起源于正常干细胞的突变。肿瘤干细胞是肿瘤组织内具有无限增殖、分化和克隆能力的一小部分细胞，该细胞移植到体内后可以形成原发肿瘤。这部分细胞与正常干细胞一样，都具有慢周期性和无限增殖的能力。肿瘤干细胞的研究将更新人们对肿瘤发生、发展和转移的认识，为目前研究肿瘤的形成提供了新的思路，为治疗肿瘤提供了新方法。 一、研究目的：本研究以人胚胎表皮和眼睑鳞状细胞癌为研究对象，通过观察人胚胎表皮的发育过程，研究人胚胎表皮干细胞的分布及生物学特性；探讨表皮鳞状细胞癌组织中是否存在肿瘤干细胞并研究其生物学特性；初步比较表皮干细胞和相关恶性肿瘤干细胞的异同。这些研究为新的肿瘤发生机制提供了理论依据，并为表皮恶性肿瘤的靶向治疗打下了基础。 二、实验方法： 实验材料的收集：胚胎组织取自中山大学第三附属医院合法流产胎儿，胚龄从8W～38W不等。眼睑鳞状细胞癌取自2005年7月～2006年6月期间在中山眼科中心四区接受手术的患者，病理诊断由本中心病理室作出。SUNE1鳞状细胞癌细胞系由中山大学肿瘤防治中心友情提供。 1 取不同胚龄胚胎全身不同部位皮肤标本，作形态学观察和免疫组织化学鉴定。 取不同胚龄人皮肤标本，用10﹪福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片，每片5μm，HE染色及免疫组化染色。第一抗体有P63， K19，CKAE1/AE3；以PBS替代一抗为阴性对照； 2 取新鲜胚胎皮肤组织进行表皮细胞体外培养及免疫组化鉴定新鲜胚胎皮肤组织经含双抗的PBS液冲洗后，采用组织块培养法进行人胚胎表皮细胞原代培养，并作原代细胞的免疫组化鉴定。 3 人眼睑皮肤鳞状细胞癌形态学观察及免疫组化鉴定； 取人眼睑皮肤鳞状细胞癌标本，用10﹪福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，每片5μm，HE染色及免疫组化染色(第一抗体为P63)。 4 人眼睑皮肤鳞状细胞癌体外培养及免疫组化鉴定取新鲜人眼睑皮肤鳞状细胞癌组织，经含双抗的PBS液冲洗后，采用组织块培养法进行癌细胞体外培养，并作原代细胞的免疫组化鉴定。 5 SIYNE1鳞状细胞癌细胞系体外细胞克隆实验SLYNE1鳞状细胞癌细胞系由中山大学肿瘤防治中心提供。复苏SUNE1细胞，按20个/ml，50个/ml，100个/ml的细胞浓度，在10mm直径细胞培养皿中进行细胞克隆。14天后细胞进行台盼兰染色，记数克隆率。观察形成的克隆大小，并对克隆分类。 6 SLINE1鳞状细胞癌细胞系亚细胞群比率流式检测复苏SUNE1细胞。按5×10<'6>细胞浓度，依次用1﹪多聚甲醛固定细胞，破膜剂破膜，PE标记的P63抗体对细胞进行荧光染色。流式细胞仪检测阳性细胞比率。 7 半定量RT-PCR．法检测SUNE1细胞中表皮发育基因表达提取SUNE1细胞总RNA，RT-PCR法检测总RNA中表皮发育基因P63，PCNA，K1，β1-integrin，K15的表达情况；β-actin作内参。 三、实验结果 1．人胚胎表皮形态学及免疫组化研究9W人胚胎表皮标本仅见两层细胞，深层为立方形的基底细胞，外层为扁平的周皮细胞。胚龄大于10W的标本见基底层细胞开始分裂，依次向外长出棘层，颗粒层，透明层和角质层细胞；同时，毛发开始出现。9W左右的标本P63染色仅见基底细胞层部分细胞阳性，而10W后，P63染色可见不仅基底细胞层部分细胞，毛囊外根鞘隆突部位部分细胞均显示阳性。小于10W的标本，干细胞只存在于基底细胞层，而10W后的标本，干细胞存在于基底细胞层和毛囊外根鞘两个部位。K19染色可见表皮多层细胞弥漫性阳性，因此可证明K19不适合做为表皮干细胞特异性的标记物。CKAE1/AE3染色在表皮多层细胞中均呈阳性，提示这些细胞均已向角质细胞分化。 2．人胚胎表皮细胞体外培养干细胞研究原代细胞成多边型或不规则型，P63染色见阳性细胞散在分布，取倒置显微镜下一个高倍镜(200×)视野中阳性细胞占细胞总数的比率(重复三次)，约为15﹪左右，即认为在表皮细胞原代培养中，干细胞约占15﹪。 3．人眼睑鳞状细胞癌形态学及免疫组化研究癌细胞向下生长至真皮内，呈现不规则的上皮细胞团块。细胞较大，胞浆丰富，部分细胞呈空泡状。可见核分裂像。P63染色可见较多的胞核强阳性细胞，提示肿瘤增殖能力旺盛。 4．人眼睑鳞状细胞癌体外原代培养形态学观察及免疫组化研究原代细胞可见细胞较大，多呈不规则型。细胞核分裂像多见。P63染色见大部分细胞胞核阳性，高倍镜(200×)视野下阳性细胞率可高达50﹪以上。 5．S15NE1细胞体外克隆实验研究分别计算细胞浓度为20个/ml，50个/ml及100个/ml下SUNE1细胞的克隆率，均可达到50﹪左右。根据克隆形成面积大小，可初步将克隆分为大克隆和小克隆。分别做大、小克隆的P63免疫组化鉴定，可见大、小克隆大部分细胞均成阳性染色。 6．流式细胞仪检测SUNE1细胞亚群比率P63阳性细胞群约占9.8﹪。 7．半定量RT-PCR法检测S13NE1细胞中表皮分化基因的表达分别检测SUNE1细胞中P63，CK1，CK15，β1-integrin，PCNA等5种常见表皮细胞分化基因的表达。可见PCNA表达最强，CK15次之，P63和β1-integrin表达较弱，CK1未见表达表达。 四、结论 1．在正常胚胎表皮(包括眼睑表皮)中有表皮干细胞的存在。 2．在人眼睑鳞状细胞癌组织中，同样有干细胞的存在，即肿瘤干细胞。 3．正常胚胎表皮原代细胞培养P63染色阳性率约为15﹪；而人眼睑鳞癌原代细胞培养P63染色阳性率高于50﹪。因此表明鳞癌组织中干细胞含量远远大于正常表皮组织中干细胞含量。 4．SUNE1鳞状细胞癌细胞系中，约有50﹪细胞长期具有增殖能力，并能形成大小不同的克隆。所有克隆P63染色均呈阳性，表明所有克隆均由肿瘤干细胞增殖而来。 5．SUNE1细胞中，表皮发育基因P63和β1-integrin弱表达，CK15较强表达，表明肿瘤细胞仍具有分化的潜能。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章实验材料和方法

第三章实验结果

第四章讨论

全文小结

问题与展望

参考文献

致谢

原创性声明