人成熟期增生性瘢痕皮肤与正常皮肤来源的表皮干细胞生物学特性的研究

摘要

研究背景
　　皮肤(Skin)是人体最大的器官，作为人体第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下组织及其附属器组成。表皮干细胞(EpidermalStemCells，ESCs)作为皮肤及其附属器发生的源泉，具有维持皮肤新陈代谢和正常生理功能的作用[1-2]。
　　瘢痕(Scar)是皮肤创伤愈合过程中必然的和必需的产物。当皮肤出现创伤时，ESCs具有促进创面再上皮化的能力，主动参与创面修复从而加速创面愈合。其促进创面愈合的机制可能为:①当皮肤组织受到损伤时，伴随着修复信号的启动，ESCs增殖能力增强，并加速分化为相应的细胞并向表皮上层迁移，主动地参与损伤修复，促进创面愈合;②当损伤创缘毛囊内的毛囊干细胞接到损伤修复的指令，能够立即启动毛囊隆突部的毛囊干细胞，主动的参与修复[3]。近些年来，随着对表皮干细胞特有的生物学特性研究的深入，人们开始考虑从细胞生物学角度考虑运用表皮干细胞为临床治疗提供新的策略。但其研究的表皮干细胞(ESCs)主要来源于正常皮肤(NormalSkin，NS)，而有关成熟期增生性瘢痕(HypertrophicScar,HS)表皮干细胞的生物学特性的研究尚无报道。且在整形手术中，经常有大量的瘢痕皮肤被切除丢弃，这就造成了本可再利用的宝贵资源的浪费。因此，本实验就成熟期增生性瘢痕（瘢痕组）表皮干细胞(HS-ESCs)的生物学特性进行研究，并与正常皮肤（对照组）表皮干细胞(NS-ESCs)进行对比研究，为HS-ESCs的应用提供研究基础。
　　目的
　　1.对HS-ESCs与NS-ESCs的生物特性进行对比研究，明确HS-ESCs的生物学特性。
　　2.通过明确HS-ESCs的生物学特性，为增生性瘢痕的治疗找到一个全新的预防和治疗的方向;
　　3.为HS-ESCs的科学研究和临床应用研究提供前期的研究基础。
　　材料与方法
　　1.取人成熟期HS和NS，通过HE染色，对比成熟期增生性瘢痕和正常皮肤的组织结构。
　　2.取人成熟期HS和NS，通过免疫组织化学检测角蛋白19、整合素β1在成熟期HS和NS中的表达情况，确定成熟期HS中是否存在ESCs。
　　3.取人成熟期HS和NS，采用两步酶消化法分离表皮细胞，Ⅳ胶原快速粘附分选纯化ESCs，贴壁培养，观察细胞形态结构。
　　4.取原代培养的ESCs，应用CCK-8检测HS-ESCs和NS-ESCs的生长特点，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生长特点。
　　5.取原代培养的ESCs，利用免疫细胞化学技术，检测角蛋白19、整合素β1及核蛋白p63在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物学特性。
　　6.取原代培养的ESCs，利用流式细胞技术，检测角蛋白19、整合素β1及CD49f在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，并确定原代培养的成熟性HS-ESCs的细胞比例。
　　7.取原代培养的ESCs，利用Western-Blot技术，检测角蛋白19、整合素β1及p63蛋白在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物学特性。
　　8.取原代培养的ESCs，利用real-timePCR技术检测Oct4基因和Nanog基因在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物学特性。
　　结果
　　1.通过HE染色，成熟期HS与NS的表皮层细胞排列整齐，层次分明。通过免疫组织化学检测CK19、整合素β1在成熟期HS和NS中均呈阳性表达，且两者间表达情况没有统计学差异(P＞0.05)，可以推断成熟期HS存在ESCs。
　　2.原代培养细胞观察其形态，HS-ESCs和NS-ESCs均呈水滴状，椭圆形，呈铺路石样排列。CCK-8检测原代培养的ESCs的增殖能力，第1-2天细胞增殖较慢，3-5天呈对数增殖，6-7天趋于平缓，两组间增殖能力没有统计学差异（P＞0.05）。
　　3.免疫细胞化学技术检测角蛋白19、整合素β1及p63的表达情况，两组间没有统计学差异(P＞0.05);利用流式细胞技术检测角蛋白19、整合素β1及CD49f的表达情况，两组间阳性细胞百分比见存在统计学差异(P＜0.05);WesternBlot检测CK19、整合素β1及p63蛋白的表达情况，两组间没有统计学差异(P＞0.05);real-timeRT-PCR技术检测Nanog基因和Oct4基因的表达情况，两组间没有统计学差异(P＞0.05)。
　　结论
　　1.在成熟期的增生性瘢痕中存在着ESCs;
　　2.通过两步酶消化法，Ⅳ胶原快速分选能够从成熟期的增生性瘢痕得到ESCs，且其具有与正常皮肤的ESCs相同的生物学特性，但是成熟期的增生性瘢痕中ESCs数量较正常皮肤的ESCs少。
　　3.成熟期增生性瘢痕来源的ESCs具有正常皮肤来源的ESCs相同的生物学特性，完全可以替代正常皮肤来源的ESCs应用于科学研究中，如组织工程研究人工皮肤等提供皮肤细胞种子等;应用于临床应用研究中，如作为皮肤细胞的种子和皮肤更新的源泉，应用于临床修复难愈性创面或者大面积皮肤缺损的治疗等，不仅避免了含有大量宝贵ESCs的资源浪费，也减轻了从正常皮肤提取ESCs带给患者的伤害。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

第一章 免疫组织化学法对瘢痕皮肤与正常皮肤ESCs的研究

前言

第一节 成熟期增生性瘢痕皮肤与正常皮肤HE染色观察组织结构

第二节 成熟期增生性瘢痕皮肤正常皮肤免疫组织化学法检测ESCs

附图

第二章 瘢痕皮肤与正常皮肤ESCs生物学特性的研究

前言

第一节 成熟期增生性瘢痕皮肤与正常皮肤ESCs的分离培养及生长特性的对比研究

第二节 成熟期增生性瘢痕皮肤正常皮肤ESCs生长特性的对比研究

第三节 流式细胞检测技术对瘢痕皮肤与正常皮肤ESCs的对比研究

第四节 蛋白免疫印迹技术检测对成熟期增生性瘢痕皮肤与正常皮肤ESCs的对比研究

第五节 荧光实时定量检测技术对成熟期增生性瘢痕皮肤与正常皮肤ESCs的对比研究

附图

讨论

结论

参考文献

综述 表皮干细胞的研究进展

个人简历及在校期间发表的文章

致谢