乙型肝炎病毒Pre-C/BCP突变热点的焦磷酸测序方法的建立及其可靠性研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起急性肝炎及慢性肝病的主要原因，其长期慢性感染还与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。在全世界，约有3.5亿的慢性HBV感染者，而我国就约有1.2亿，每年与乙型肝炎相关的死亡人数达30万例左右，占传染病死亡第一位。HBV作为嗜肝脱氧核糖核酸病毒科中的一员，其复制为逆转录复制，缺乏校对功能，并在人体免疫、外界药物等因素的共同影响下，常易发生变异。其中，Pre-C/BCP的突变最为突出，并在慢性肝病患者中常见。Pre-C常见突变热点有G1896A、G1899A，BCP常见突变位点有A1762T、G1764A、C1766T。这些突变不仅可以导致血清中病毒标志物的改变，改变机体对感染细胞的免疫反应，还可改变HBV复制能力，如增加HBV病毒的毒力，导致较严重的肝病活动，促进慢性肝病向肝硬化及肝癌发展的进程，与暴发性肝炎、重型肝病及肝癌的发生密切相关。因此，如何准确可靠地诊断相应位点的基因突变，是HBv相关疾病准确诊断和科学治疗的基础，亦是预后最重要的参考依据，故急需建立其相应的准确可靠的临床诊断方法。而目前对于HBV Pre-C/BCP基因突变的检测的常用检测方法有DNA测序法、PCR-RFLP(PCR及限制性片段长度多态性分析法)、荧光实时PCR LightCycler法及基因芯片检测技术。这些方法虽都能较好地检测相应的突变，但各有其显著的不足之处，如PCR-RFLP，PCRLightCycler每次只能检测一个突变位点，不能同时对多位点突变进行检测；DNA测序法和基因芯片检测技术花费昂贵、步骤烦琐，距临床检测要求都存在着明显的距离，不能作为常规临床检测技术而广泛应用于临床。故急需寻找新的检测方法和技术，以满足临床工作的需要。 焦磷酸测序作为一种新型DNA测序技术，可通过检测DNA合成过程中所释放的焦磷酸而获得待测核苷酸序列，具有高准确性、高通量、高自动化、重复性好等优点，费用低廉，适合临床批量检验的特点，有望适用于HBV Pre-C/BCP多位点基因突变的检测。但由于该技术起步较晚，迄今国内外尚未见运用焦磷酸测序技术对Pre-C/BCP突变位点的检测的报道。为此，我们在前期研究YMDD焦磷酸测序技术的基础上，开展此研究，以期探索一种新的自动化和高通量检测HBV Pre-C/BCP热点突变的方法。研究目的： 在我们前期研究YMDD焦磷酸测序技术的基础上，以焦磷酸测序技术为平台，建立一种检测Pre-C/BCP突变热点的检测方法，并验证该方法的准确性、重复性、可靠性及进行初步临床检测，以期建立一种高效、高通量、自动化、低成本的Pre-C/BCP突变位点的临床检测方法。 材料与方法： 1、材料 1．1参考标准品(血清)参考标准品1为6份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>)，具有Sanger测序法检测结果；参考标准品2为12份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>)，具有基因芯片检测法的结果。 1．2 PCR扩增及电泳相关材料核酸提取液，PCR扩增引物，10mm dNTP，10x PCR buffer，琼脂糖等。 1．3焦磷酸测序相关材料70﹪乙醇、2×洗涤结合缓冲液、超级顺磁性磁珠、复性缓冲液、SQA Reagent Kit、PSQ96孔板、PSQ 96 Sample Vacuum Prep Tool、PSQ 96 Sample Vacuum PrepWorktable、PSQ96MA测序仪等(Biotage公司)。 1．4临床待检血清标本60份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>，HBeAg阴性)。 2、方法及观察项目2．1焦磷酸测序片断的PCR扩增方法的建立及其PCR扩增产物的检测先进行梯度PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否为本实验的目标扩增片段及确定最佳退火温度后，在此基础上对参考标准品及临床待检血清标本的Pre-C/BCP突变区进行批量化的焦磷酸测序片断的扩增。 2．2 Pre-C/BCP焦磷酸测序检测方法的建立对参考标准品1的PCR产物的Pre-C/BCP突变区进行焦磷酸测序。先将参考标准品1的PCR产物磁珠固定，通过PSQ 96 Sample Vacuum Prep Tool、Worktable及相关试剂进行碱变性，洗涤，将DNA双链转变为单链，再加入测序引物与单链退火杂交，最后在PSQ96MA测序仪中进行测序。 2.3焦磷酸测序法的精确性、可靠性、重复性的验证2.3.1参考标准品的焦磷酸测序结果分别与Sanger测序法、基因芯片检测法的结果进行对照。 2.3.2参考标准品1的90次重复焦磷酸测序结果进行对照。 2.4临床待检血清标本的焦磷酸测序检测运用焦磷酸测序技术，一次性对60份临床待检血清标本的PCR产物同时进行Pre-C/BCP多个突变位点的检测。 结果： 1、焦磷酸测序片断的扩增方法的建立通过梯度PCR实验及系列实验，确定了本研究的最适PCR条件为：最佳退火温度为54℃后，获得了约260bp的目标片断，并在此基础上对参考标准品及临床待检血清进行批量化的焦磷酸测序片断的扩增，结果显示10<'4>滴度水平以上的78例HBV血清标本均获得了有效扩增，阳性率达100﹪。 2、Pre-C/BCP焦磷酸测序检测方法的建立首先应用焦磷酸测序对参考标准品1的PCR产物进行检测，成功建立了Pre-C/BCP焦磷酸测序检测方法，其结果与Sanger。法测序结果的符合率为100﹪，提示焦磷酸测序技术是一种高精确性的检测技术。 3、参考标准品2的焦磷酸测序检测结果及相符性分析参考标准品2的焦磷酸测序结果与其既往3个月内的基因芯片检测结果的符合率达11/12，仅有1例不符合，不排除该例存在继发突变可能。由此可见，焦磷酸测序技术是一种可与基因芯片检测技术相媲美的，准确率高的临床检测方法。 4、焦磷酸测序技术的可靠性、重复性验证本实验对参考标准品1进行90次重复焦磷酸测序，其测序结果符合率为100﹪，表明了焦磷酸测序技术是一种检出率高，重复性好的可靠的检测技术。 5、临床待检血清标本的焦磷酸测序检测在前述研究的基础上，我们一次性对60份标本的多位点突变进行测序检测，结果显示：共检出60例，26例有位点突变，其中一例还发现了T1758C突变。结果表明：本实验建立的基于焦磷酸测序技术的Pre-C/BCP突变检测技术，在临床标本检测中，亦达到了高通量、多位点及自动化的检测目的，有望成为一种新的临床检测方法。结论： 本实验针对临床急需的Pre-C/BCP基因突变的检测所建立的焦磷酸测序技术是一种准确性高、重复性好、可靠性强、可一次性检测HBV Pre-C/BCP多位点突变的高通量的检测方法，其高度自动化、低成本、可多位点和批量化检测的优点，使之有望成为一种极好的的临床检测技术。

目录

文摘

英文文摘

第一章引言

第二章材料和方法

2.1主要材料

2.2实验方法

第三章结果

3.1焦磷酸测序片断的扩增方法的建立

3.2 Pre-C/BCP焦磷酸测序检测方法的建立

3.3参考标准品2的焦磷酸测序检测结果及相符性分析

3.4焦磷酸测序技术的可靠性、重复性验证

3.5临床待检血清标本的焦磷酸测序检测

第四章讨论

第五章结论

参考文献

在学期间以发表的论文

致 谢

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