白色念珠菌细胞壁缺陷株与药物敏感株筛选方法的初步建立

摘要

近20年来，真菌感染尤其是深部真菌感染的频率和严重性急剧增加，寻找治疗深部真菌感染的药物十分迫切，而现有药物由于其毒性和副作用使得其应用受到极大的限制。本论文以最重要的致病真菌之一白色念珠菌为模型，高通量筛选白色念珠菌细胞壁缺陷及药物敏感的突变株，以期为研究新型的高效低毒的抗真菌药物打下基础。 本研究首先采用反义RNA技术，将白色念珠菌反义cDNA文库转化白色念珠菌缺陷型菌株CAI-4(△ura3::imm434/△ura3::imm434)，在无脲嘧啶的YNB培养基上筛选出大量基因表达降低或沉默突变体，通过优化转化条件，使转化效率达到了170个/μg质粒。然后进一步采用几丁质结合染料Calconuor white(CFW)作为筛选因子获得一批细胞壁合成缺陷的突变菌株，在随机选取的200个沉默突变体中，获得了50个CFW超敏感的突变菌株。将分离获得的细胞壁缺陷突变株进行离体药物敏感性分析，在此选用了美国临床标准化委员会推荐的M27-A方案，以ATCC90028作为质控菌株，并将突变株与原始菌株CAI-4进行比较，以获得用于进一步克隆细胞壁上药物靶点基因和进行药物筛选的有利突变株，在50株CFW敏感株中，大部分菌株对伊曲康唑和卡泊芬净表现出敏感。最后通过采用TDPCR、Hot start PCR、缩小PCR反应体系等措施优化扩增基因组DNA的PCR条件，获得了清晰、特异的扩增条带，为以后进一步进行基因功能分析和获得影响细胞壁合成相关基因打下了坚实的基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

1.1研究背景

1.2研究现状

1.3本论文的主要研究内容和研究意义

第2章材料和方法

2.1材料

2.2实验方法

第3章结果与分析

3.1白色念珠菌电转化条件的优化

3.2细胞壁缺陷转化子的筛选

3.3细胞壁缺陷株的药物敏感性实验

3.4白色念珠菌细胞壁合成相关基因PCR条件的优化

第4章讨论与展望

4.1白色念珠菌的转化

4.2利用CFW筛选细胞壁合成缺陷型菌株

4.3离体药物敏感性实验

4.4 PCR扩增条件的优化

第5章结论与展望

参考文献

缩略词

致 谢

论文原创性声明