VEGF-C和-D在鼻咽癌中的表达及阻断VEGF-C作用对淋巴管内皮细胞和鼻咽癌细胞增殖的影响

摘要

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种恶性程度较高的头颈部恶性肿瘤，在欧洲、北美洲、大洋洲和拉丁美洲等西方国家较少见，在我国则是最常见的恶性肿瘤之一。全世界约80％鼻咽癌发生在我国，尤以广东省珠江三角洲流域最常见，所以鼻咽癌也被称为“广东瘤”(Canton Tumor)。鼻咽癌对放疗很敏感，放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段。鼻咽癌对化疗也较敏感，目前鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期经过综合治疗的五年生存率分别是95％、80％、62％、40％。但鼻咽癌病人就诊时大部分(约70％)为中晚期，中晚期鼻咽癌有较高的局部复发率及远处转移率，严重影响了鼻咽癌生存率的提高。鼻咽癌的转移途径包括局部浸润、淋巴转移和血行转移。其中颈淋巴结转移是鼻咽癌最主要的转移途径和部位，发生率可高达78.9％，而且转移出现早，与预后密切相关。如何提高鼻咽癌的局控率、减少转移，是目前鼻咽癌研究的主要任务之一。 转移是所有恶性肿瘤最主要的行为特征，也是导致肿瘤治疗失败、患者死亡的主要原因之一。如何控制肿瘤转移是目前肿瘤治疗中的难题之一。研究发现肿瘤转移的主要途径是淋巴转移和血行转移，肿瘤诱导淋巴管和血管形成、增生是肿瘤生长、转移的先决条件。自上世纪70年代开始，肿瘤诱导血管生成对肿瘤转移的影响已为越来越多的肿瘤研究者所重视，目前抗肿瘤血管生成治疗已成为抗肿瘤研究热点之一，抗肿瘤血管生成治疗(如贝伐单抗Bevacizumab，商品名Avastin，一种重组的人源化单克隆IgG1抗体，是血管内皮生长因子抑制剂)已进入临床并取得了良好的治疗效果。而肿瘤转移的另一重要方式——淋巴转移，研究相对落后。而临床病理学研究证实：大多数上皮起源的实体瘤以淋巴道转移为主，最早发生的是区域淋巴结播散，而播散的最早途径是淋巴管通道。因此目前对肿瘤淋巴道扩散与转移机制的基础和临床研究对于攻克恶性肿瘤更具重要性和迫切性。近几年国外研究表明：淋巴管生成是受血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的成员血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF—C)和血管内皮生长因子D(vascular endothelial growth factor D，VEGF—D)控制，这些生长因子分泌激活后主要与血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factot receptor 3，VEGFR-3，即Flt-4)结合，可促进淋巴管内皮细胞增殖和淋巴管增生，促进肿瘤淋巴道转移，而直接针对VEGF-C/VEGF—D或其受体VEGFR-3的肿瘤淋巴管生成抑制剂，可能对人类肿瘤的抗淋巴道转移治疗有益。但目前此领域的研究相对较少。 基于以上研究现状，本课题拟从临床病理标本和细胞分子生物学水平两个部分，研究鼻咽癌中VEGF-C和-D的表达情况及其与区域淋巴结转移、远期生存等肿瘤生物学特征的关系，并初步探讨VEGF-C在鼻咽癌淋巴管生成中的调控机制，试图为探寻新的抗鼻咽癌淋巴转移的治疗手段提供思路。 1.背景及目的VEGF—C和VEGF—D是目前已鉴定出的淋巴管内皮生长因子，一些研究表明肿瘤组织中VEGF—C或VEGF-D过表达和淋巴转移有关。本研究旨在探讨鼻咽癌中VEGF-C和VEGF-D的表达情况及其临床意义。 2.方法 采用SP法免疫组化染色技术检测66例鼻咽癌组织中VEGF-C和VEGF-D的表达情况，同时检测VEGFR-3和CD34染色情况并计数微淋巴管密度(lymphatic microvessel density ，MVD)和微血管密度(microvessel density，MVD)。 3.结果 VEGF—C阳性高表达率在鼻咽癌组织中(54.5％)较鼻咽非肿瘤组织中(26.3％)高(P<0.05)；鼻咽癌中VEGF-C高表达者较低表达者区域淋巴结转移率增高(62.0％：38.096)、T分期也相对增高，单因素及多因素Logistic回归分析均表明区域淋巴结转移与VEGF-C高表达相关(P<0.05)，但VEGF-C高表达与性别、年龄、5年生存、LMVD、MVD等因素无关(P>0.05)。VEGF-D阳性表达率在鼻咽癌组织中(69.7％)较鼻咽非肿瘤组织中(42.1％)高(P<0.05)；鼻咽癌中VEGF-D阳性表达与性别、年龄、T分期、区域淋巴结转移、LMVD、MVD等因素无关(P>0.05)，但与VEGF-C高表达呈显著正相关(P<0.01)，VEGF-D阳性表达者5年生存率(50.0％)显著低于VEGF—D不表达者(85.0％)(P<0.01)。 4.结论 鼻咽癌中VEGF-C阳性高表达与区域淋巴结转移密切相关；VEGF-D阳性表达与区域淋巴结转移无关，但与VEGF-C阳性高表达呈正相关，且与5年生存率密切相关。 1.背景与目的VEGF—C通过与受体VEGFR-3结合，可促进淋巴管内皮细胞增殖和淋巴管增生，促进肿瘤淋巴道转移。本研究旨在检测人鼻咽癌细胞株中VEGF-C表达情况，并探讨体外阻断VEGF-C作用对淋巴管内皮细胞和鼻咽癌细胞增殖的影响。 2.方法 2.1.采用定性RT—PCR和实时荧光定量RT—PCR检测三株常见人鼻咽癌细胞株中VEGF-C的表达情况。 2.2.取人淋巴管内皮细胞(human lymphatic endothelial cell，HLEC)，调整细胞数为5×103/ml，加入96孔培养板，每孔100ul。实验分为5组，细胞生长24小时后，每孔加入各种试剂100u1。第①组：HLEC．VS．HLEC+抗VEGFR-3抗体；第②组：HLEC．VS．HLEC+高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清；第⑨组：HLEC+高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清．VS．HLEC+高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清+抗VEGFR-3抗体；第④组：HLEC．VS．HLEC+低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清；第⑤组：HLEC+低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清．VS．HLEC+低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清+抗VEGFR-3抗体。加试剂后24h、48h、72h、96h、120h观察各组淋巴管内皮细胞生长情况并计算细胞数，比较各组细胞增殖情况。 2.3.分别收集高表达VEGF-C的人鼻咽癌细胞和低表达VEGF-C的人鼻咽癌细胞，调整细胞计数为5X104/ml，将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔接种量为1X104个细胞，体积为200ul。实验分为两组，第①组：高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞．VS．高表达VEGF—C的鼻咽癌细胞+抗VEGFR-3抗体；第②组：低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞．VS．低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞+抗VEGFR-3抗体。加试剂后24h、48h、72h、96h、120h用MTT法检测各组细胞增殖情况。 3.结果 3.1.定性RT—PCR发现三株常见人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2和HNE2均表达VEGF-C，实时荧光定量RT-PCR发现，这三株人鼻咽癌细胞VEGF-C mRNA差异较大，分别是1.02×106 copy/μg、3.11×104 copy/μg和8.31×104 copy/μg。 3.2.加入抗VEGFR-3抗体的HLEC和未用抗VEGFR-3抗体处理的HLEC增殖速度无明显差异(P=0.625)；加入高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清后，HLEC增殖速度明显加快(P=0.031)；加入高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清的同时加入抗VEGFR-3抗体，HLEC的增殖速度较仅加入高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清的HLEC的明显减慢(P=0.038)；加入低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清后，HLEC的增殖速度也加快，但没有统计学意义(P=0.054)；加入低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清的同时加入抗VEGFR-3抗体，HLEC的增殖速度较仅加入低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞上清的HLEC的也有所减慢，但也没有统计学意义(P=0.062)。 3.3.向高表达VEGF-C的鼻咽癌细胞培养液中加入抗VEGFR-3抗体，鼻咽癌细胞增殖速度明显减慢(P=0.019)；向低表达VEGF-C的鼻咽癌细胞培养液中加入抗VEGFR-3抗体，鼻咽癌细胞的增殖速度稍减慢，但没有统计学意义(P=0.080)。 4.结论 4.1.三株常见的人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2和HNE2均表达VEGF-C，但差异较大。 4.2.鼻咽癌细胞分泌VEGF-C对HLEC有促增殖作用，阻断VEGF-C作用可以阻断其对HLEC的促增殖作用。但低于一定浓度阈值的VEGF-C对HLEC促增殖作用不明显，这种情况下阻断VEGF-C作用对HLEC增殖影响不大。 4.3.阻断鼻咽癌细胞分泌的VEGF-C的作用可以减慢鼻咽癌细胞本身的增殖，但当鼻咽癌细胞分泌的VEGF-C低于一定浓度阈值时，阻断其作用对鼻咽癌细胞本身增殖影响不大。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词

声明

第一部分VEGF-C和-D在鼻咽癌中的表达及其临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分VEGF-C在人鼻咽癌细胞株中的表达及阻断VEGF-C作用对淋巴管内皮细胞和肿瘤细胞增殖的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

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