单基因遗传病致病基因的突变检测——遗传性痉挛性截瘫和先天性角化不良

摘要

单基因疾病是指那些由于单个基因的缺陷而引起的遗传病，其发生基本上受一对等位基因控制，其传递方式符合孟德尔遗传定律Ⅲ。目前对单基因遗传病已知致病基因的突变筛查和新基因的克隆是进行基因诊断的主要方法之一，应用最广泛的技术就是对PCR产物直接测序来确定突变的位置和类型。本文主要应用这种方法进行几种单基因疾病致病基因的突变筛查，运用单倍型分析、跨物种同源序列比对、野生型和突变型蛋白质结构预测等生物信息学方法鉴定病理性突变。 遗传性痉挛性截瘫(Hereditary Spastic Paraplegia，HSP)(MIM＃182600)是一组神经系统退行性疾病，其具有临床表型多样性以及很强的遗传异质性。根据遗传方式不同HSP可分为常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)、常染色体隐性遗传(autosomal reeessive，AR)和X连锁隐性遗传(X-linked recessive，XR)，其中以AD-HSP最常见。SPATACSIN(spasticity、with thin or atrophied corpus eallosum syndrome protein)是SPGll(MIM＃610844)位点的致病基因，也被称作皿K1AA1840或者FLJ21439。目前发现SPG11基因的突变是伴发胼胝体发育不良的常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫(ARHSP-TCC)的主要发病原因。考虑到HSP的异质性，本文应用PCR产物直接测序的方法对15个AR-HSP家庭(26个患者)和18个散发病例，共44个病人进行了SPG11基因的突变筛查。我们在一个广东惠州ARHSP-TCC的家庭中发现新的复合型杂合突变，c．[5121-5122insAG]+[6859C>T](p．[11708RfsX2]+[Q2287X])。对家庭的遗传分析显示母亲是突变c．5121—5122insAG的携带者，父亲是突变c．6859C>T的携带者。患者由于同时存在两个突变导致发病，而弟弟和妹妹因只具备其中之一故表型正常。详尽的临床和实验室检查显示带有复合型杂合突变的HSP患儿还伴有胼胝体发育不良、智力障碍和小脑代谢降低。母源性突变c．5121_5122insAG为第29外显子剪接位点的插入，虽然通过spliceview预测，剪接方式并没有改变，但是导致下游的移码突变，p．I1708RfsX2；父源性突变c．6859C>T为第38外显子的无义突变，即第228位密码子从谷氨酰胺变为终止密码子，p．Q2287X，两突变都引起肽链合成提前终止。该突变发生在进化上高度保守的碱基，在对照组中阙如。通过构建单倍型，提示在这个家庭中，同时具有这两个突变的单倍型才会发病。二级结构预测提示SPATACSIN基因编码的野生型蛋白有5个跨膜区，这两个突变都导致第一个跨膜区的方向发生了逆转，并且在原一、二跨膜区之间又增加了一个跨膜区。同时发生31个基序的丢失以及α螺旋和β折叠数量的改变。本文鉴定了SPG11基因的新的复合型杂合突变导致一个中国家庭发生ARHSP-TCC，为该病的产前基因诊断提供了一个新的证据。先天性角化不良(dyskeratosis congenim，DC)(MIM 305000)是一种罕见的先天性多系统损害的综合征。早期表现主要以皮肤网状色素沉着、甲萎缩和黏膜白斑三联征为特征。80％患者在30岁以前出现一系甚至三系血细胞减少，发生进行性骨髓造血功能衰竭，引起患者早年死亡。DC具有遗传异质性，其中主要的遗传方式是X连锁隐性DC(XR-DC)，大约占DC病例90％以上。编码蛋白角化不良素(DYSKERIN)的DKCl基因的突变与XR-DC有关。我们对两个DC的家庭进行了临床和遗传学研究。家庭1中的两个儿子都是患者，病情一轻一重。家庭2中先证者和弟弟均是患者，病情严重，随访调查，现都已病逝。 我们应用PCR产物直接测序的方法进行DKCl基因的突变筛查。家庭1中两个患者都有DKCl基因的同一突变，c．1058C>T(p．A353V)。他们母亲表型正常，这个位点直接测序为C和T的杂合峰，为突变基因杂合子。此突变是已知突变，国内外均已报道过数次，为一热点突变，大约30％男性患者都检测到这一突变。家庭2，在先证者和弟弟都发现一个突变c．1075C>T(p．D359N)，由于家庭中其他人的血液样本暂时没有采集到，遗传检测有待进一步进行。这个突变在国际上只报道过一例散发病例，在中国人群中是首次报道。两个突变位置很近，位于DKCl基因编码蛋白角化不良素(DYSKERIN)的同一个推定的RNA结合区域，该区域与DC的发病有关，且对端粒酶RNA和H/ACA类核仁小RNA的结合有特殊的作用。另外，我还做了遗传性色素性异常症、掌趾角化病和斑驳病等皮肤科遗传病的突变筛查。鉴定了一些遗传变异，但是在现阶段它们的功效还不能肯定，需要进一步的实验。

目录

文摘

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声明

第一部分SPG11基因的新突变导致伴发胼胝体发育不良的常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫

引言

第一章材料和方法

1.1研究对象

1.2临床表型分析

1.3遗传分析所用主要试剂、材料和仪器

1.4突变检测

1.5突变的致病性鉴定

1.6单倍型的构建

1.7核型分析

第二章结果

2.1带有SPG11突变的广东惠州家庭患者的临床特征

2.2 SPG11基因的突变检测结果

2.3跨种属的同源序列的比对结果

2.4单倍型的分析结果

2.5野生型和突变型SPG11蛋白的二级结构预测结果

2.6核型分析结果

第三章讨论

第二部分X染色体连锁隐性先天性角化不良致病基因的突变鉴定

引言

第一章材料和方法

1.1研究对象

1.2临床表型分析

1.3遗传分析

第二章结果

2.1临床检查结果

2.2突变检测结果

2.3跨种属序列比对结果

第三章讨论

总结

参考文献

附图

致谢