甲酸诱导酿酒酵母细胞活性氧爆发及细胞凋亡机理研究

摘要

甲酸是具有杀菌作用的小分子有机酸，甲醇即因为在人体内被代谢为甲酸而具有毒性。已有研究者证明甲酸的毒性与它对线粒体内电子传递链末端的细胞色素氧化酶的抑制有关。本文以酿酒酵母W303-1a株和BY4741株为研究对象，发现用60mM甲酸处理酿酒酵母细胞后，可观察到细胞凋亡的主要表型，如细胞核收缩、染色体断裂和磷脂酰丝氨酸外翻等。但敲除酵母细胞凋亡的关键基因，即酵母caspase1基因(YCA1)后，仍然观察到部分细胞呈现出凋亡的表型，同时细胞的存活率没有上升，表明这种细胞凋亡过程并非Ycalp依赖。文中进一步探讨了甲酸使酵母细胞凋亡的主要原因，首次证明较低浓度(30mM-60mM)的甲酸可在10min内导致酿酒酵母细胞内活性氧形成，最终引起细胞内活性氧的剧烈爆发，还原剂预处理和线粒体活性缺陷会提高甲酸处理后的细胞存活率。本文还发现YCA1基因的缺失或酶活性抑制会使甲酸诱导的细胞内活性氧上升更快，细胞的死亡率更高。而过量表达YCA1的细胞和野生型细胞相比，其活性氧水平和细胞死亡率没有差别。本文还发现YCA1的缺失会导致活性氧爆发过程或衰老细胞中线粒体活性降低。凋亡诱导因子Aifl的基因缺失会导致细胞中线粒体活性降低及甲酸处理死亡率的下降。同时，论文中还用GFP标记酿酒酵母线粒体内膜上的ATP复合酶，分析GFP荧光在甲酸诱导的活性氧爆发过程中的变化，发现用低浓度的甲酸处理后，GFP荧光迅速消失，推测甲酸诱导的活性氧爆发可能直接或间接导致GFP结构的破坏。 综上所述，本文首次证明以较低浓度甲酸处理酿酒酵母细胞可引起活性氧的迅速爆发，导致不依赖于Ycalp的细胞凋亡。这一结果有助于进一步理解和阐明甲酸及甲醇的细胞毒性机理。Ycalp抑制活性氧爆发的相关机理有待进一步阐明。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

第一章前言

1.1细胞凋亡的概念与意义

1.2细胞凋亡的调控

1.3凋亡过程的关键酶——Caspase

1.3.1 Caspase的概念及其功能

1.3.2 Caspase的起源

1.4活性氧及其与凋亡的联系

1.4.1活性氧概念及功能

1.4.2细胞内活性氧的来源

1.5甲酸毒性机理的研究

1.6酵母细胞凋亡研究

1.6.1酵母细胞凋亡现象

1.6.2酵母caspase研究

1.6.3酿酒酵母凋亡过程中线粒体的中心地位

1.6.4酿酒酵母凋亡相关因子和抗氧化的关系

1.6.5酵母菌凋亡的表型及其分析方法

1.6.6凋亡对于酵母菌的意义

1.6.7酿酒酵母Ycalp在凋亡之外的其他功能

第二章低浓度甲酸诱导的酿酒酵母凋亡现象研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1仪器与设备

2.2.2菌株、质粒和培养基

2.2.3生长曲线和甲酸处理后酵母细胞存活率测定

2.2.4 DAPI染色法

2.2.5细胞的Annexin-V-FITC染色及观察分析

2.2.6 TUNNEL染色和分析

2.2.7 RH123染色法观察线粒体膜电位

2.2.8 Caspase活性检测

2.2.9 Hoechst 33342染色观察

2.2.10质粒的酵母细胞转化

2.3结果与分析

2.3.1酿酒酵母W303-1a生长曲线和甲酸处理后存活率测定

2.3.2甲酸处理后各种凋亡表型的检测

2.3.3酵母野生型和YCA1突变株的凋亡特征表型比较

2.4讨论与结论

2.4.1讨论

2.4.2结论

第三章低浓度甲酸诱导的线粒体活性氧爆发研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1仪器与设备

3.2.2酵母菌菌株、质粒及培养基

3.2.3酵母细胞的培养

3.2.4不同浓度甲酸处理后的酵母细胞存活率测定

3.2.5超氧化物水平测定

3.2.6细胞内活性氧的激光共聚焦显微镜检测

3.2.7细胞内活性氧爆发的流式细胞仪检测

3.2.8 Rh123染色法检测线粒体膜电位

3.2.9质粒DNA的提取

3.2.10 DNA的凝胶纯化

3.2.11 DNA浓度的测定

3.2.12 ssDNA的制备

3.3结果与分析

3.3.1甲酸处理后酿酒酵母细胞内产生活性氧

3.3.2甲酸处理后细胞内活性氧水平快速上升

3.3.3甲酸处理后细胞内超氧化物水平上升

3.3.4酿酒酵母线粒体活性影响甲酸处理下细胞内活性氧的爆发和细胞死亡

3.3.4Aiflp影响甲酸诱导的细胞死亡率和线粒体膜电位

3.4讨论与结论

3.4.1讨论

3.4.2结论

第四章酵母Yca1p对酵母细胞活性氧爆发及线粒体稳定性的影响

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1仪器与设备

4.2.2酵母菌菌株、质粒和培养基

4.2.3线粒体荧光标记菌株的构建

4.2.4 YCA1过表达菌株的诱导表达

4.2.5细胞培养和细胞存活率测定

4.2.6活性氧的观察和检测

4.2.7细胞质活性氧爆发过程变化的流式细胞仪分析

4.2.8线粒体膜电位的检测

4.3结果与分析

4.3.1 YCA1基因的缺失增加甲酸处理后酵母细胞膜的破坏

4.3.2 YCA1突变不影响对数生长期细胞初始线粒体膜电位

4.3.3 YCA1缺失不影响线粒体超氧阴离子产生水平

4.3.4酵母Yca1p抑制或基因敲除提高细胞中活性氧的水平

4.3.5 YCA1过表达不影响活性氧爆发后细胞的存活率

4.3.6甲酸诱导活性氧爆发过程中YCA1缺失降低了线粒体活性

4.3.7衰老细胞中YCA1缺失使线粒体活性降低

4.3.8线粒体内膜上的GFP在活性氧爆发过程中被迅速破坏

4.4讨论与结论

4.4.1讨论

4.4.2结论

参考文献

和论文相关的主要研究成果

致谢