甜菜夜蛾核多角体病毒在Se301细胞中的持续感染研究

摘要

杆状病毒是一类双链环状DNA病毒，可特异性地感染包括许多重要农业经济害虫在内的节肢动物。杆状病毒持续感染在野外昆虫宿主种群中普遍存在。在某些条件刺激下，持续感染可转变为增殖性感染，并引发流行病。因此，杆状病毒持续感染对昆虫种群动力学以及病毒流行病学的研究具有重要意义。但是，目前仍未建立一个较好的病毒-宿主模型来研究杆状病毒持续感染的机制。本论文以甜菜夜蛾核多角体病毒(SeMNPV)及其宿主细胞Se301作为研究对象，首次建立了SeMNPV持续感染的Se301细胞系，并从中克隆了一株不产生可感染性病毒但可抑制SeMNPV感染的细胞株，为研究杆状病毒在昆虫细胞中持续感染的分子机制奠定了基础。
　　 虽然SeMNPV感染Se301细胞最终导致细胞裂解死亡，但当SeMNPV在Se301细胞中无稀释连续传代时，其子代病毒感染性逐渐降低。本研究中，在Se301细胞中无稀释传至第8代的SeMNPV感染Se301细胞后，少量细胞能够存活，并保持增殖能力。我们将该细胞系命名为P8-Se301。P8-Se301细胞群体生长速度慢于Se301细胞，4.14±0.99％的细胞可持续释放可感染性的芽生型病毒，部分细胞中可见多角体和病毒发生基质等病毒感染特征。SeMNPV感染P8-Se301细胞，细胞的病理现象没有明显增加；芽生型病毒和多角体总数的产量与未感染P8-Se301细胞的类似。P8-Se301细胞释放的子代病毒vP8-Se301与SeMNPV共同感染Se301细胞后，其病毒滴度较野生型SeMNPV感染细胞所产生的滴度低，表明vP8-Se301对SeMNPV具有干扰作用。Dot blot分析表明，提取的P8-Se301总DNA中的0.21％为SeMNPV的基因组成分。Southern blot和PCR分析表明，虽然P8-Se301细胞的胞内病毒基因组包含了大部分SeMNPV基因组片段，但仍缺失了部分SeMNPV基因组片段。实时荧光定量PCR测定表明，在每个P8-Se301细胞中平均含有(4.40±2.14)×103个SeMNPV多角体蛋白基因(polh)拷贝。RT-PCR可检测到P8-Se301细胞中SeMNPV极早期基因ie-0、早期基因dnapol、晚期基因orf67和极晚期基因polh的转录本。以上结果证实了P8-Se301细胞是一株SeMNPV持续感染的细胞。
　　 利用单细胞克隆方法，从P8-Se301细胞中得到一株细胞克隆，命名为P8-Se301-C1。P8-Se301-C1细胞形态与Se301细胞相似，细胞中未见多角体和病毒发生基质等病毒感染特征。但与P8-Se301一样，其细胞群体生长速度较Se301细胞的慢。TCID50终点稀释法和感染中心测定表明，P8-Se301-C1细胞不产生可感染性病毒。SeMNPV感染P8-Se301-C1细胞的子代病毒产量较其感染Se301的显著下降，表明P8-Se301-C1细胞具有抑制SeMNPV复制的能力。实时荧光定量PCR分析表明，在SeMNPV感染细胞1h内，进入P8-Se301-C1细胞和Se301细胞中的病毒数量无显著性差异；但Dot blot分析表明，在SeMNPV感染6h时或之前，其DNA复制在P8-Se301-C1细胞中受到抑制，证明P8-Se301-C1细胞对SeMNPV感染的干扰作用是发生在病毒进入细胞后，DNA复制时或复制前的早期感染阶段。以提取的P8-Se301-C1细胞的总DNA为模板，PCR可扩增得到SeMNPV ie-0和polh基因片段，但不能得到dnapol和orf67基因片段，表明P8-Se301-C1细胞中含有不完整的SeMNPV基因组。Dot blot分析表明，1.25×105个P8-Se301-C1细胞中含有0.32±0.16 ng SeMNPV DNA。实时荧光定量PCR表明，单个P8-Se301-C1细胞中SeMNPV polh基因的拷贝数为13.24±4.27。巢式RT-PCR可检测到P8-Se301-Cl1细胞中的SeMNPV polh基因转录本。以上结果表明P8-Se301-C1含有少量不完整的SeMNPV基因组，但不产生子代病毒，说明该细胞可能存在SeMNPV潜伏感染。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

前 言

第一章 杆状病毒对宿主种群生态的影响(文献综述)

1.1 杆状病毒生物学简介

1.1.1 杆状病毒形态和分类

1.1.2 杆状病毒的生活周期和感染过程

1.1.3 杆状病毒的分子生物学

1.2 杆状病毒对宿主种群生态的影响

1.2.1 杆状病毒在环境中的持续存在

1.2.2 杆状病毒的传播

1.2.3 杆状病毒感染的克服

1.2.4 亚致死影响

1.2.5 潜伏/持续感染

第二章 材料与方法

2.1 主要仪器

2.2 实验材料

2.2.1 昆虫

2.2.2 细胞系

2.2.3 病毒

2.2.4 菌种与质粒

2.2.5 常用培养基

2.2.6 主要试剂及试剂盒

2.2.7 常用缓冲液及溶液

2.3 实验方法

2.3.1 病毒虫体扩增

2.3.2 昆虫细胞培养与保存

2.3.3 细胞群体生长测定

2.3.4 单细胞克隆

2.3.5 病毒感染细胞

2.3.6 病毒cosmid DNA转染昆虫细胞

2.3.7 病毒的性质测定

2.3.8 电镜观察

2.3.9 病毒DNA的提取及酶切

2.3.10 PCR

2.3.11 常规基因克隆及测序

2.3.12 细胞总RNA的提取

2.3.13 RT-PCR

2.3.14 Southern blot分析

2.3.15 Dot blot分析

2.3.16 实时荧光定量PCR分析

第三章 SeMNPV持续感染Se301细胞系的建立

3.1 前言

3.2 结果与分析

3.2.1 SeMNPV持续感染细胞的建立

3.2.2 P8-Se301细胞生长曲线的测定

3.2.3 P8-Se301细胞形态及病理学观察

3.2.4 P8-Se301细胞中病毒的感染性测定

3.2.5 P8-Se301细胞对SeMNPV的干扰测定

3.2.6 vP8-Se301可干扰SeMNPV在Se301细胞中的复制

3.2.7 P8-Se301细胞中SeMNPV基因组DNA的含量分析

3.2.8 P8-Se301细胞的胞内病毒基因组分析

3.2.9 RT-PCR检测PS-Se301细胞病毒基因的转录

3.2.10 P8-Se301细胞中持续感染病毒的激活尝试

3.3 讨论

3.3.1 持续感染细胞的建立受不同病毒-细胞体系影响

3.3.2 P8-Se301具有持续感染细胞的典型特征

3.3.3 SeMNPV的持续感染细胞可能依赖于连续传代后的突变病毒

3.3.4 P8-Se301细胞含有的SeMNPV缺损基因组分析

3.3.5 P8-Se301细胞中少多角体表型相关基因fp25K的分析

3.3.6 ie-1在SeMNPV和AcMNPV中可能具不同功能

3.3.7 持续感染病毒的激活

3.4 小结

第四章 P8-Se301细胞克隆株的分离及性质研究

4.1 前言

4.2 结果与分析

4.2.1 克隆细胞株P8-Se301-C1的建立

4.2.2 P8-Se301-C1的细胞形态特征

4.2.3 P8-Se301-C1细胞群体生长测定

4.2.4 P8-Se301-C1细胞中不含可感染性的病毒粒子

4.2.5 P8-Se301-C1细胞含有SeMNPV基因组的分析

4.2.6 P8-Se301-C1细胞中SeMNPV基因的RT-PCR分析

4.2.7 P8-Se301-C1细胞对SeMNPV复制的干扰分析

4.2.8 SeMNPV在P8-Se301-C1细胞中重新建立持续感染

4.2.9 P8-Se301-C1细胞中病毒的激活

4.3 讨论

4.3.1 P8-Se301-C1细胞不产生可感染的子代病毒，但含有SeMNPV基因组

4.3.2 P8-Se301-C1细胞含有不完整的SeMNPV基因组

4.3.3 P8-Se301-C1类似一株潜伏感染细胞

4.3.4 P8-Se301-C1细胞对SeMNPV的同源干扰机制

4.4 小结

总 结

展 望

参考文献

在学期间发表的论文

附 录 引物汇总

致 谢