重组甜菜夜蛾核多角体病毒(SeXD1)病理学研究及对宿主消化生理的影响

摘要

甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)属鳞翅目夜蛾科，分布广，危害严重。近年来除危害多钟蔬菜外，还危害许多大田农作物和经济作物，是一种重要的农业害虫，常爆发危害。甜菜夜蛾核多角体病毒是一种专一性强，能有效防治甜菜夜蛾的病原微生物。利用甜菜夜蛾核多角体病毒防治甜菜夜蛾，不仅安全性好、而且有利于保护天敌和生态环境，害虫也不易产生抗性，此外其还能在环境中积累，达到长期控制害虫种群的目的。其经济和生态效益良好。然而与化学杀虫剂相比，野生型SeMNPV存在明显缺陷，即杀虫速度慢，其在田间喷施后一般需3～5d甚至一周才能让目标害虫染病死亡，因而造成作物不必要的损失。为了克服这个缺点，人们正在尝试利用基因工程技术改造SeMNPV。现已通过在虫体内重组和体内体外交替克隆的方法成功地构建了SeMNPV重组病毒(命名为SeXD1)。该重组病毒在基因组13.7～21.6图距的位置缺失了10593bp的基因组信息，其中包括egt，gp37，几丁质酶基因，组织蛋白酶基因和几个SeMNPV所独有的基因。SeXD1能够在昆虫细胞Se301和SeUCR中正常复制并形成病毒包涵体，可明显提高杀虫速度，是一株具有开发潜力的重组病毒。鉴于SeXD1良好的应用前景，本文系统研究了该病毒对宿主不同龄期的致病力、病毒对宿主生理消化的影响以及病毒在宿主体内复制和表达的情况。研究结果对该重组病毒的大量增殖及田间应用具有重要的指导意义。 用CLL模型模拟分析了两种病毒5种剂量对不同龄期甜菜夜蛾幼虫的毒力，考查了不同病毒剂量效应和时间效应的指标值LD50和LT50值。并绘制了甜菜夜蛾累积死亡率随时间和剂量变化的三围曲面图，综合评价了两种病毒处理不同龄期甜菜夜蛾幼虫的时间效应和剂量效应，比较了两种病毒间对不同龄期幼虫的致病力。结果表明，SeXD1的杀虫速度比野生型病毒提前一天，杀虫效果明显提高，另外随着龄期的增长，甜菜夜蛾对两种病毒的抵抗力都急剧增强。 用SeXD1和野生型wt—SeMNPV分别感染甜菜夜蛾5龄初幼虫，通过比重分析法测定了染毒后甜菜夜蛾幼虫消化生理的变化，结果表明，在低浓度剂量下，两种病毒对甜菜夜蛾幼虫消化生理的影响无显著性差异；高剂量下，SeXD1更明显抑制甜菜夜蛾的取食，取食量比感染野生型病毒降低40％，比对照下降84％。 用免疫印迹与实时荧光定量方法以POLH蛋白和polh基因作标记，同步分析了两种病毒处理幼虫后在虫体三种组织中复制和表达情况。结果表明：在虫体内，SeXD1和wt—SeMNPV感染的幼虫，24h后就能在中肠和血淋巴检测到POLH蛋白，而脂肪体要在48h才能检测到，SeXD1和wt—SeMNPV在表达时相上无明显差异，但是它们在虫体内的复制速度差异显著，在感染后的24h内，病毒处于潜伏期，24-48h处于缓慢增长期，48h—72h处于快速增长期，其中野生型病毒的复制速度较ScXD1快，但其在不同组织中的复制动力学是一致的。

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文摘

英文文摘

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前言

第一章 重组病毒SeXD1毒力测定

引言

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.2方法

1.2结果和分析

1.2.1两种病毒对不同龄期甜菜夜蛾幼虫的毒力测定

1.2.2时间-剂量-死亡率模型拟合分析

1.2.3 SeXD1感染甜菜夜蛾幼虫后的死亡特征

1.3讨论

第二章 SeXD1对甜菜夜蛾幼虫消化生理的影响

引言

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2实验方法

2.2结果分析

2.2.1 SeXD1对甜菜夜蛾5龄幼虫取食量的影响

2.2.2 SeXD1对甜菜夜蛾消化生理影响

2.2.3 SeXD1对甜菜夜蛾体重增加的影响

2.3讨论

第三章 SeXD1在甜菜夜蛾幼虫不同组织复制与表达

引言

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1抗体效价测定

3.2.2 SeXD1和wt-SeMNPV感染甜菜夜蛾幼虫后不同组织多角体蛋白的合成

3.2.3常规PCR鉴定两种病毒

3.2.4标准回归曲线的建立和回归方程的设定

3.2.5荧光定量PCR检测虫体不同组织的病毒DNA

3.3讨论

第四章 文献综述

4.1杆状病毒基本概况

4.1.1杆状病毒的基本特性

4.1.2杆状病毒的侵染机制

4.2杆状病毒的分子生物学

4.3杆状病毒应用研究概况

4.3.1杆状病毒作为杀虫剂

4.3.2杆状病毒作为表达系统

4.4甜菜夜蛾核多角体病毒研究进展

总结与展望

参考文献

附录 缩略词

致谢