信号蛋白TOR与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系

摘要

雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)属于磷脂酰肌醇激酶的相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK)超家族，是一类进化上非常保守的蛋白激酶，广泛存在于各种生物细胞。信号蛋白TOR是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-Akt信号通路下游的一个效应蛋白，在细胞存活中处于核心地位，在多种因素的活化下参与基因转录、蛋白质翻译起始、细胞凋亡等多种生物学过程。很多病毒在感染过程中可通过调控宿主细胞PI3K-Akt-TOR信号通路来完成病毒的复制。此外，PI3K-Akt-TOR信号通路的参与还参与了肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)、放线菌素D(actinomycin D，ActD)等细胞外因子诱导的细胞凋亡。
　　 先前本室已表明草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞Sf9中存在PI3K-Akt信号通路，且该通路在杆状病毒感染昆虫细胞以及诱导昆虫细胞凋亡过程中起着重要作用。为了对鳞翅目昆虫细胞中PI3K-Akt信号通路进行较为完整和全面的研究，本文对PI3K-Akt信号通路的下游信号蛋白TOR在杆状病毒代表种——苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)感染Sf9细胞过程中所起的作用进行了研究。同时也对TOR在Sf9细胞凋亡过程中所起的作用进行了初步的探索。
　　 使用TOR的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin)处理Sf9细胞，随着雷帕霉素浓度的升高，被处理细胞的增殖率降低，说明雷帕霉素对Sf9细胞增殖起到了抑制作用，且此抑制作用为浓度依赖型。此外，RNA干扰(RNA interference)下调Sf9细胞中TOR的表达也能抑制细胞的增殖。表明Sf9细胞中存在信号蛋白TOR。
　　 利用特异性识别磷酸化TOR的抗体进行Western blot分析表明，AcMNPV感染导致Sf9细胞中磷酸化TOR的水平在1 hpi(hours post-infection)升高，且高水平的磷酸化TOR可持续到18hpi。结果表明AcMNPV感染Sf9细胞能磷酸化激活细胞中的信号蛋白TOR。
　　 AcMNPV在Sf9细胞中的有效增殖需要TOR。在病毒感染细胞后各时间点利用雷帕霉素处理细胞抑制TOR后，芽生型病毒(budded virus)和包涵体(occlusion body)的产量都显著降低。在2hpi加入雷帕霉素处理细胞，对子代病毒产量的影响与感染前加入雷帕霉素的相近，说明雷帕霉素并不影响病毒进入细胞。在8hpi和12hpi加入雷帕霉素对子代病毒产量的影响逐渐降低。24hpi加入雷帕霉素则不影响子代病毒的复制。这些结果表明，病毒进入细胞后的早期复制过程对PI3K-Akt-TOR信号通路的依赖性较强，随后逐渐减弱，感染24h后病毒不再依靠此信号通路进行增殖。Slot blot和Western blot检测发现当TOR受到抑制后，病毒DNA合成，以及病毒晚期基因(38K)和极晚期基因(多角体蛋白)的表达均受到一定程度的抑制，但病毒早晚期基因(gp64)的表达水平接近。上述结果证明TOR对AcMNPV在Sf9细胞中复制具有重要作用。
　　 TOR在调节细胞存活和凋亡过程中起着关键性的作用。利用雷帕霉素抑制TOR后，杆状病毒或放线菌素D诱导的Sf9细胞凋亡受到抑制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

前 言

第一章文献综述

1.1杆状病毒与细胞凋亡

1.1.1 杆状病毒简介

1.1.2细胞凋亡极其信号转导途径

1.1.3 杆状病毒诱导的昆虫细胞凋亡

1.2 P13K-Akt-TOR信号通路概况

1.2.1 P13K简介

1.2.2 Akt简介

1.2.3 TOR简介

1.2.4 P13K-Akt-TOR信号通路的主要功能

1.3病毒感染与P13K-Akt-TOR信号通路

1.3.1 病毒对细胞P13K-Akt-TOR信号通路的调节

1.3.2病毒调节细胞P13K-Akt-TOR信号通路对细胞的影响

1.3.3杆状病毒与细胞信号通路

第二章材料与方法

2.1实验材料和仪器

2.1.1细胞和病毒

2.1.2质粒和菌株

2.1.3主要试剂

2.1.4主要溶液及其配制

2.1.5仪器

2.2方法

2.2.1 病毒的虫体感染增殖

2.2.2虫体内多角体的分离纯化

2.2.3病虫血淋巴制备

2.2.4 昆虫细胞的离体培养

2.2.5病毒感染细胞

2.2.6病毒滴度测定

2.2.7细胞内病毒多角体的计数

2.2.8蛋白印迹(Western blot)

2.2.9细胞胞内总DNA的提取

2.2.10 Slot blot分析

2.2.11 RNA干扰(RNA interference，RNAi)

2.2.12活细胞计数

第三章PDK-AKT-TOR信号通路在AcMNPV感染SF9细胞过程中的作用

3.1前言

3.2结果

3.2.1 雷帕霉素处理抑制Sf9细胞的增殖

3.2.2 AcMNPV感染后激活Sf9细胞TOR

3.2.3抑制TOR信号通路降低子代病毒的产量

3.2.4不同时间点加入雷帕霉素对子代病毒产量的影响

3.2.5不同浓度雷帕霉素对子代病毒产量的影响

3.2.6抑制TOR导致病毒DNA的合成降低

3.2.7抑制TOR导致病毒晚期和极晚期基因的表达受到抑制

3.2.8 RNA干扰下调TOR抑制Sf9细胞的增殖

3.3讨论

3.4 小结

第四章PI3K-Akt-TOR信号通路与SF9细胞凋亡的关系

4.1前言

4.2结果

4.2.1 雷帕霉素抑制vAcP35-KO-PH-GFP诱导的Sf9细胞凋亡

4.2.2雷帕霉素抑制ActD诱导的昆虫细胞凋亡

4.3讨论

4.4 小结

总 结

展望

参考文献

在读期间发表的论文

致谢