公开/公告号CN112852882A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-05-28
原文格式PDF
申请/专利权人 中吉智药(南京)生物技术有限公司;
申请/专利号CN202110159142.2
申请日2021-02-04
分类号C12N15/866(20060101);C12N15/864(20060101);C12N7/01(20060101);C12N15/55(20060101);C12N15/35(20060101);C12N15/12(20060101);C12N5/10(20060101);C12N9/48(20060101);C07K14/47(20060101);
代理机构11613 北京易捷胜知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人齐胜杰
地址 211199 江苏省南京市江北新区新锦湖路3-1号中丹生态生命科学产业园一期A座618室
入库时间 2023-06-19 11:08:20
技术领域
本发明涉及基因药物技术领域，尤其涉及一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV基因药物的系统及方法。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一，是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.70kb左右的线状单链DNA基因组。基于AAV设计的重组腺相关病毒是一种重要的基因治疗载体，具有安全可控性。
AAV作为一种复制缺陷型DNA病毒，其复制需辅助病毒共感染完成。基因组结构如图1所示。在构建rAAV的过程中，WtAAV的rep和cap基因被用于研究的目的基因的表达系统所代替，只保留了AAV基因组两端的两个ITRs。ITRs在rAAV的复制、包装过程中具有重要的生物功能，是rAAV载体必备的DNA序列。构建包含目的基因的重组病毒载体，且易于高效生产是研发rAAV介导的基因治疗药物的基础。目前广为采用的生产rAAV的方法之一是三质粒共转染法，即用目的基因和相关的功能片段替代WtAAV病毒的rep和cap基因形成一个病毒载体质粒；生产所必需的腺病毒辅助基因形成另一个助质粒；腺相关病毒包装结构基因(cap)和非结构复制基因(rep)组成第三个质粒，将这三种质粒转染稳定表达Ela、EIb辅助病毒基因的包装细胞系HEK293，即可生产出具有感染活性的rAAV。近年来也有研究者提出，将两个辅助质粒整合到一个质粒进行双质粒转染的报道，但需要克服Rep蛋白对辅助病毒的抑制作用。从rAAV被用作基因载体开始，研究者就在尝试各种提供功能元件的方式，以达到方便、灵活、大量地生产能满足研究和临床所需rAAV的目的，迄今提供元件的方式主要有质粒、病毒和细胞系，现有的方法或单纯地用一种方式或几种方式组合联用。
因质粒在真核细胞中不能复制，就无法产生子代去感染更多宿主细胞，所以质粒转染法不能实现“已感染细胞将未感染细胞转化为已感染细胞”的能力，无论是贴壁系统还是悬浮培养系统，都只能通过扩大培养面积或体积、同时加大质粒用量来扩大其规模。目前报道的最大规模为用100层的Cell Cube作为容器，细胞容量为10
与之前转染方法相比，病毒感染法无须瞬时转染，也不需要建立稳定转染的细胞系，所有元件都由病毒提供且采用人体细胞生产rAAV需要扩增和转染贴壁细胞，在生产过程中无法完全脱离质粒转染贴壁细胞这一限制性步骤。从背蓿银纹夜蛾核型多角体病毒得到的一种重组杆状病毒被应用于昆虫细胞生产的rAAV生产系统，彻底解决了上述难关。此方法在rAAV的生产工艺上具有很大的改进，包括∶彻底摆脱了瞬时质粒感染贴壁细胞，无须辅助病毒或其基因，具有灵活性(可生产不同类型的rAAV)、生产成本低(可以在无血清的培养基中生产)，可以耐受一系列的摩尔渗透压，可以在悬浮培养基中进行连续的大规模生产，生产得率和总量完全达到临床和市场化要求，外源基因可高效表达。
在杆状病毒/昆虫细胞生产体系中需要3种不同的杆状病毒，分别为∶①Bac-Rep∶含有rAAV的Rep52和Rep78，分别由多角体蛋白启动子(Polyhedrin promotor)和IE(Immediate-early gene)启动子调控；②Bav-VP或Bac-Cap∶含有3种cap基因VP1、VP2和VP3，由多角体蛋白启动子调控；③Bac-Transgene∶含有由rAAV末端重复序列包裹的转基因，由昆虫p10和哺乳动物巨细胞病毒(CMV)启动子共同调控。在具体的操作中，首先将3种杆状病毒分别感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf9)细胞分别进行扩增，将纯化后的3种杆状病毒共感染悬浮培养的rAAV昆虫生产细胞。在生产过程中定期检测被感染的细胞量、成活率和rAAV产量等参数以优化生产工艺。在最佳时间段收获细胞并提取和提纯rAAV病毒，之后检测rAAV的产量和质量。迄今，以杆状病毒为基础的rAAV生产系统纯化后的滴度可达2.00×10
自从首次报道了一种基于杆状病毒的表达系统在昆虫细胞中生产AAV以来，这种方法得到了越来越多的关注。已有几个研究小组报道了使用昆虫细胞来产生AAV载体。但由于AAV内含子和启动子在昆虫细胞中不能正常发挥作用，这些研究大多在两个表达盒中使用了两个独立的Rep编码序列，一个是Rep78，另一个是Rep52，构建的杆状病毒中两个编码序列以头尾回文排列。此外，这些研究使用了VP1起始密码子突变(从AUG到ACG)的Cap编码序列。由于Rep78和Rep52具有较大的同源重复序列，有报道称携带该Rep的同源重复序列的重组杆状病毒是不稳定的(同源重组带来不稳定性)，经过几代后，Rep蛋白表达丢失。也有报道称，在昆虫细胞中产生的带有VP1起始密码子AUG-to-ACG突变的AAV载体，由于VP1蛋白表达相对较差，感染活性较低。此外有科学家研究设计构建了一个新的人工内含子，并将其插入Rep和Cap的编码序列中，以表达Rep和Cap蛋白。含有该人造内含子的单个Rep编码序列同时表达了Rep78和Rep52蛋白，这就可以避免使用大量的同源Rep重复，从而使携带Rep编码序列的重组杆状病毒具有更高的稳定性。与此同时，由于单个含内含子的Cap编码序列就可以表达所有三种Cap蛋白(VP1、VP2和VP3)，因此保留了真实的VP1起始密码子AUG(避免感染活性降低)。最后，建立了利用这些插入了内含子的Rep和Cap编码序列在昆虫细胞中生产AAV载体的方法，所得AAV载体的产率与之前的方法相当，且具有较强的感染性。但是在Rep和Cap蛋白中插入外源内含子会增加基因调控的复杂性，且生产效率较低。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV基因药物的系统及方法，避免使用两个独立的Rep编码序列(Rep78和Rep52)进行同源重组造成的杆状病毒不稳定性的问题，无需在Rep和Cap蛋白中插入外源内含子，减少基因调控的复杂性，在提高生产效率的同时，所得AAV的外源基因可高效表达。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的方法，其包括：
S1:将编码Rep78蛋白和编码Rep52蛋白的两个表达盒的其中之一与编码Cap蛋白VP2(VP2包含VP3序列)的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第一杆状病毒；
将编码Rep78蛋白和编码Rep52蛋白的两个表达盒的另一个与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第二杆状病毒；
S2:将携带目的基因表达盒的AAV载体序列克隆到第三杆状病毒载体上，得到第三杆状病毒；
S3:贴壁培养Sf9细胞，在需要产AAV病毒时，利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共感染Sf9细胞，生产携带目的基因的AAV。
上述步骤S1-S2无顺序限制，可同时完成或者分步完成。
根据本发明的较佳实施例，步骤S2中，第三杆状病毒的基因组上整合了质粒序列pFast-Bac-AAV-Target Gene，其中Target Gene表示目的基因，AAV为腺相关病毒的表达盒序列。
根据本发明的较佳实施例，步骤S2中，所述Target Gene为SMN1基因，其序列如SEQID No:7所示，用于制备治疗脊肌萎缩症的AAV基因药物；
或者，所述Target Gene为编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列SEQ ID No:8或SEQ ID No:9，SEQ ID No:8所示序列编码可溶性胞外区ACE21-620片段，SEQ ID No:9编码可溶性胞外区ACE21-740的片段，使制备的AAV感染靶细胞后靶细胞产生可溶性ACE2蛋白到胞外(ACE2蛋白可与冠状病毒S蛋白特异结合)，由此制得拮抗SARS-CoV感染的AAV基因药物。
根据本发明的较佳实施例，步骤S2中，第三杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-AAV-Target Gene质粒载体，将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-Target Gene；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-Target Gene转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第三杆状病毒。
根据本发明的较佳实施例，步骤S1中，将编码Rep78蛋白与编码Cap蛋白VP2的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，得到第一杆状病毒；将编码Rep52蛋白与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，得到第二杆状病毒；
第一杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒载体，该质粒载体中含p10-VP2-polyhedrin-Rep78序列(如SEQ ID No:6所示)；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第一杆状病毒；
第二杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体，该质粒载体中含p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列(如SEQ ID No:5所示)；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第二杆状病毒。
根据本发明的较佳实施例，S1中，构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体的方法为：
步骤1：将pFast-Bac-dual质粒用限制性内切酶进行双酶切处理后，琼脂糖电泳后切胶回收pFast-Bac-dual载体片段，将pFast-Bac-dual载体片段分别与编码VP2和编码VP1的基因片段采用连接酶连接；
将连接产物转化感受态DH5a，经混匀、冰浴、热休克后再立即并浴，先用无抗生素的液体培养基培养后，再转入含有氨苄青霉素的琼脂平板上继续培养，之后挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素液体培养液中振荡培养，提取质粒并进行双酶切鉴定后进行测序鉴定，分别对应获得pFast-Bac-dual-VP2质粒和pFast-Bac-dual-VP1质粒；
步骤2：将pFast-Bac-dual-VP2质粒和pFast-Bac-dual-VP1质粒分别用限制性内切酶进行双酶切后，分别进行琼脂糖电泳后切胶回收pFast-Bac-dual-VP2载体片段和pFast-Bac-dual-VP1载体片段；
将pFast-Bac-dual-VP2载体片段与编码Rep78的基因片段连接，将pFast-Bac-dual-VP1载体片段与编码Rep52的基因片段采用连接酶连接；
将连接产物分别转化感受态DH5a，经混匀、冰浴、热休克后再立即并浴，先用无抗生素的液体培养基培养后，再转入含有氨苄青霉素的琼脂平板上继续培养，之后挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素液体培养液中振荡培养，提取质粒并进行双酶切鉴定后进行测序鉴定，成功构建得pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒载体和pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体；
通过上述两次限制性内切酶进行双酶切和连接酶连接后，使pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒载体含有p10-VP2-polyhedrin-Rep78序列(如SEQ ID No:6所示)，pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体含有p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列(如SEQ ID No:5所示)。
根据本发明的较佳实施例，S1中，制备重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1的方法为：
将pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体，稀释后，分别转染感受态DH10Bac，经混匀、冰浴、热休克后再立即并浴，先用无抗生素的液体培养基培养后，再转入含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的琼脂平板上继续培养，进行蓝白斑筛选；
挑取白色的大个的单克隆至新鲜的无抗生素的平板培养基上，进行二次划线至含有卡那霉素，庆大霉素，四环素，X-gal，IPTG的琼脂平板上，进行培养后再次筛选；
之后挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素，庆大霉素和四环素的液体培养液中培养，用酚氯仿分别提取重组质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1，用M13F与M13R进行鉴定，至此分别获得重组质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1。
根据本发明的较佳实施例，S1中，获得第一杆状病毒和第二杆状病毒的方法为：
取重组质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1稀释后，再加入经过稀释的转染试剂，将重组质粒与转染试剂的混合物同时加到贴壁的Sf9细胞中，经培养一段时间后，换新鲜培养基；观察细胞，当大部分细胞体积变大、超半数的细胞悬浮起来时，离心收取上清，分别获得第一杆状病毒和第二杆状病毒；所述第一杆状病毒基因组上整合了pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒序列，第二杆状病毒基因组上整合了pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒序列。
根据本发明的较佳实施例，步骤S3中，利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共感染Sf9昆虫细胞，感染72h后收取细胞，反复冻融裂解细胞，获取细胞裂解液，层析纯化，生产携带目的基因的AAV。
作为上述方案的一个并列方案，如下：
步骤S1中，将编码Rep78蛋白与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，得到第一杆状病毒；将编码Rep52蛋白与编码Cap蛋白VP2的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，得到第二杆状病毒；
第一杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP1质粒载体，该质粒载体中含p10-VP1-polyhedrin-Rep78序列；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP1；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP1转染贴壁的Sf9细胞，得到第一杆状病毒；
第二杆状病毒的制备方法为：构建pFast-Bac-dual-Rep52/VP2质粒载体，该质粒载体中含p10-VP2-polyhedrin-Rep52序列；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP2；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP2转染贴壁的Sf9细胞，得到第二杆状病毒；所述第一杆状病毒基因组上整合了pFast-Bac-dual-Rep78/VP1质粒序列，第二杆状病毒基因组上整合了pFast-Bac-dual-Rep52/VP2质粒序列。
第二方面，本发明提供一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的系统，其包括：第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒和Sf9细胞；
第一杆状病毒的基因组上整合了编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2(包含VP3序列)的表达盒，其中编码Rep78蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP2的基因由p10启动子驱动表达；
第二杆状病毒的基因组上整合了编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒，其中编码Rep52蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP1的基因由p10启动子驱动表达；
第三杆状病毒的基因组上整合了携带目的基因表达盒的AAV载体序列(pFast-Bac-AAV-Target Gene)；
利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共同感染Sf9细胞生产携带目的基因的AAV。
第三方面，本发明提供一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的系统，其包括：第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒和Sf9细胞；
第一杆状病毒的基因组上整合了编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2(包含VP3序列)的表达盒，其中编码Rep52蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP2的基因由p10启动子驱动表达；
第二杆状病毒的基因组上整合了编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒，其中编码Rep78蛋白的基因由polyhedrin启动子驱动表达，编码Cap蛋白VP1的基因由p10启动子驱动表达；
第三杆状病毒的基因组上整合了携带目的基因表达盒的AAV载体序列(pFast-Bac-AAV-Target Gene)；
利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共同感染Sf9细胞生产携带目的基因的AAV。
(三)有益效果
本发明的技术效果在于：
通过三个克隆杆状病毒，将Rep78和Rep52分离地克隆到两个不同的克隆杆状病毒中，再将携带目的基因表达盒的AAV载体序列克隆到第三个杆状病毒上，使用三个杆状病毒同时感染Sf9细胞，以产生AAV病毒。本发明的方法避免克隆到同一个杆状病毒中的两个独立的Rep编码序列(Rep78和Rep52)因同源重组造成的杆状病毒不稳定性的问题。本发明也不需要在Rep和Cap蛋白中插入外源内含子，减少基因调控的复杂性，在提高生产效率的同时，所得AAV的外源基因可高效表达。
附图说明
图1为腺相关病毒基因组结构。
图2为pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒载体中所含的p10-VP2-polyhedrin-Rep78序列(SEQ ID No:6)的结构示意。
图3为pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体中所含的p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列(SEQ ID No:2)的结构示意。
图4为本发明实施例中用第一杆状病毒和第二杆状病毒分别Sf9细胞后，细胞裂解液中Rep,Cap的表达水平。
图5为本发明实施例中用第一、第二、第三杆状病毒共感染Sf9细胞后，用sf9细胞裂解液感染U87MG细胞验证AAV中GFP的表达性。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明实施例的杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV的方法流程为：
(1)将编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2(VP2包含VP3序列)的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第一杆状病毒。
第一杆状病毒的制备流程为：
构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP2质粒载体，该质粒载体中含p10-VP2-polyhedrin-Rep78序列(如SEQ ID No:6所示)；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2转染贴壁的Sf9细胞，得到第一杆状病毒。
(2)将编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第二杆状病毒。
第二杆状病毒的制备流程为：
构建pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体，该质粒载体中含p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列(如SEQ ID No:5所示)；将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1转染贴壁的Sf9细胞，得到第二杆状病毒。
(3)将携带目的基因表达盒的AAV载体序列克隆到第三杆状病毒载体上，得到第三杆状病毒。
第三杆状病毒的制备流程为：
构建pFast-Bac-AAV-Target Gene质粒载体，将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-Target Gene；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-Target Gene转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第三杆状病毒。
(4)贴壁培养Sf9细胞，在需要产AAV病毒时，利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒共感染Sf9细胞，生产携带目的基因的AAV，具体方法为：
利用第一杆状病毒、第二杆状病毒、第三杆状病毒用MOI1，1：1：1的比例共感染Sf9细胞，感染72h后收取细胞，反复冻融裂解细胞，获取细胞裂解液，层析纯化，生产携带目的基因的AAV。
上述步骤(1)-(3)可并行完成。
其中，第三杆状病毒的基因组上整合了质粒序列pFast-Bac-AAV-Target Gene，其中Target Gene表示目的基因，AAV为腺相关病毒的表达盒序列。Target Gene可以是各种目的基因，例如Target Gene是SMN1基因(如SEQ ID No:7所示)时，可以生产出治疗脊肌萎缩症的AAV基因药物，或者Target Gene是编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列(SEQ IDNo:8或SEQ ID No:9，前者编码可溶性胞外区ACE21-620片段，后者编码可溶性胞外区ACE21-740的片段)，均可使细胞表达可溶性ACE2蛋白到胞外(ACE2蛋白可与冠状病毒S蛋白特异结合)，由此制得拮抗SARS-CoV感染的AAV基因药物。
现以目的基因为GFP为例，对本发明方案、可实现性和技术效果进行说明。实施方法如下：
一、构建pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体
载体质粒是由商业化载体pFast-Bac-dual(invitrogen 10712024)，AAV2的Rep78基因序列，Rep52基因序列，VP1基因序列和VP2基因序列构成；p10-VP1-polyhedrin-Rep52，p10-VP2-polyhedrin-Rep78构成两个质粒的核心表达盒。
Rep78序列为SEQ ID No:1，Rep52序列为SEQ ID No:2，VP1序列为SEQ ID No:3，VP2序列SEQ ID No:4，p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列为SEQ ID No:5，p10-VP2-polyhedrin-Rep78序列为SEQ ID No:6。
其中pFast-Bac-dual自带p10和polyhedrin两个启动子，通过两次限制性内切酶进行双酶切和连接酶连接，使分别将VP2(或VP1)连接在p10的一侧，而Rep78(或Rep52)连接在polyhedrin的一侧，使p10启动子驱动VP2(或VP1)，polyhedrin启动子驱动Rep78(或Rep52)。
p10-VP1-polyhedrin-Rep52序列(SEQ ID No:5)的序列结构如图3所示，p10-VP2-polyhedrin-Rep78(SEQ ID No:6)的序列结构如图2所示。
pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1构建方法如下：
(1)将pFast-Bac-dual质粒用限制性内切酶NheI和KpnI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pFast-Bac-dual载体片段。
将编码VP1基因和编码VP2基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和NheI/KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用NheI和KpnI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收编码VP1基因和编码VP2基因片段。
(2)将胶回收试剂盒分别回收的pFast-Bac-dual载体片段和编码VP1基因和编码VP2基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应15min。
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴5min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pFast-Bac-dual-VP1与pFast-Bac-dual-VP2质粒，进行NheI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pFast-Bac-dual-VP1与pFast-Bac-dual-VP2质粒。
(5)将pFast-Bac-dual-VP1与pFast-Bac-dual-VP2质粒用限制性内切酶NotI和XbaI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pFast-Bac-dual-VP1与pFast-Bac-dual-VP2载体片段。
将编码Rep78基因和编码Rep52基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和NotI/XbaI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用NotI和XbaI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收编码Rep78基因和编码Rep52基因片段。
(6)将胶回收试剂盒分别回收的pFast-Bac-dual-VP1载体片段和编码Rep52基因，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应15min。
将胶回收试剂盒分别回收的pFast-Bac-dual-VP2载体片段和编码Rep78基因，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应15min。
(7)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰30min；42℃热休克80s，立刻冰浴5min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(8)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒，进行NotI和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒构建成功。
二、获取pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1杆状病毒
将pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒载体，先转染感受态DH10Bac获得重组的杆状病毒质粒，然后以重组的杆状病毒质粒转染SF9细胞获得相应的杆状病毒，具体步骤如下：
(1)将pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒转化至DH10Bac大肠杆菌：
取pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1质粒按照不同浓度稀释，转染感受态DH10Bac，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克45s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液至1ml，37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素，庆大霉素，四环素，X-gal，IPTG的LB琼脂平板上，37℃倒置培养55h，进行蓝白斑筛选。
(2)挑取白色的大个的单克隆至新鲜的无抗LB中，进行二次划线至含有卡那霉素，庆大霉素，四环素，X-gal，IPTG的LB琼脂平板上，37℃倒置培养55h，再次进行筛选。
(3)挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素，庆大霉素和四环素的LB液体培养液中37℃振荡16h；用酚氯仿提取重组质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1，用M13F与M13R进行鉴定，至此获得重组质粒Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1。
(4)将昆虫细胞Sf9以2×10
(5)取Bac-pFast-Bac-dual-Rep78/VP2与Bac-pFast-Bac-dual-Rep52/VP1重组质粒20μl用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，取8μl CellfectinII转染试剂用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，稀释的转染试剂加入稀释的质粒中，轻弹混匀，室温静置15min。
(6)将转染试剂质粒混合物加入贴壁的Sf9细胞中，于27℃培养6h后换成新鲜的培养基。
(7)转染后每天观察细胞，当大部分细胞体积变大，有超过半数的细胞脱离培养皿表面悬浮时，4000rpm离心5min收取上清，获得P1代的pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和pFast-Bac-dual-Rep52/VP1杆状病毒。
三、pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1杆状病毒蛋白表达验证
用杆状病毒感染Sf9细胞，收取细胞后进行Western Blot检验Rep78、Rep52、VP1、VP2的表达情况。具体实验步骤如下：
(1)将昆虫细胞Sf9以2×10
(2)分别取pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1杆状病毒用MOI1感染Sf9细胞。
(3)感染72h后，分别收集收集细胞裂解获得Sf9pFast-Bac-dual-Rep78/VP2裂解液和Sf9 pFast-Bac-dual-Rep52/VP1裂解液。
(4)配制10％SDS-PAGE胶，将Sf9 pFast-Bac-dual-Rep78/VP2裂解液和Sf9pFast-Bac-dual-Rep52/VP1裂解液用BCA法进行蛋白浓度测定，向6％SDS-PAGE胶中加入相同蛋白量的细胞裂解液，用80V的电压跑至压缩胶与分离胶交界处，用120V电压跑至胶的底部。
(5)用400mA恒定电流将含有Sf9 pFast-Bac-dual-Rep78/VP2蛋白和Sf9 pFast-Bac-dual-Rep52/VP1蛋白的SDS-PAGE胶转至NC膜上。
(6)将转有Sf9 pFast-Bac-dual-Rep78/VP2蛋白和Sf9 pFast-Bac-dual-Rep52/VP1蛋白的NC膜用5％脱脂牛奶在室温孵育1h，用TBST清洗膜3次，每次5min。
(7)用Rep与Cap的一抗于4℃孵育过夜。
(8)第二天用TBST清洗膜3次，每次10min，用含有HRP的二抗室温孵育1h，用TBST清洗膜3次，每次5min。
(9)用ECL法进行显影，获得杆状病毒pFast-Bac-dual-Rep78/VP2和杆状病毒pFast-Bac-dual-Rep52/VP1的Sf9表达水平结果。
结果如图4所示，两种杆状病毒感染sf9细胞，腺相关病毒的包装组分Rep,Cap均能很好表达。
四、用pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1与pFast-Bac-AAV-GFP(addgene#40868)杆状病毒感染Sf9产AAV可行性验证
使用三个杆状病毒共感染Sf9细胞，感染72h后收取细胞，反复冻融裂解细胞获取细胞裂解液，用其通过感染靶细胞U87MG验证AAV中GFP表达的可行性。具体实验步骤如下：
(1)将昆虫细胞Sf9以2×10
(2)将pFast-Bac-dual-Rep78/VP2、pFast-Bac-dual-Rep52/VP1与pFast-Bac-AAV-GFP杆状病毒用MOI1，1：1：1的比例共感染Sf9细胞，同时取相同量的pFast-Bac-AAV-GFP杆状病毒感染Sf9细胞作为阴性对照；
(3)感染72h后，收取Sf9细胞冻于-80℃，在37℃快速融化，在漩涡振荡器上振荡5s再次冻于-80℃，重复3次后4℃，12000rpm离心10min，取细胞上清用0.22μm滤器过滤。
(4)U87MG细胞提前一天铺一块6孔板，使细胞第二天汇合度至60％，将过滤好的细胞上清感染靶细胞U87MG，72h观察GFP荧光，通过比较共感染三杆状病毒的Sf9细胞裂解液与只感染pFast-Bac-AAV-GFP杆状病毒的Sf9细胞裂解液感染U87MG的GFP荧光个数验证系统可行性。
结果如图5所示，上述三种杆状病毒感染sf9后，细胞裂解液的纯化物感染靶细胞U87MG后，在靶细胞产生绿色荧光，说明AAV携带的GFP蛋白序列在靶细胞中得到表达。由此证明，本发明的三种杆状病毒感染昆虫细胞的病毒生产系统可以高效产生AAV。
上述实施例是以目的基因为GFP为例所进行的说明，实施例中使用的pFast-Bac-AAV-GFP(addgene#40868)杆状病毒为已有杆状病毒。在实际生产应用制备AAV基因药物时，根据治疗需求携带不同的目的基因，以达到基因修复或产生特定蛋白质等的治疗目的。因而，在上述实施例的基础上，目的基因质粒可以用通式pFast-Bac-AAV-Target Gene来表示，其中，Target Gene可以是各种目的基因，例如Target Gene是SMN1基因(如SEQ ID No:7所示)时，可以生产出治疗脊肌萎缩症的AAV基因药物，或者Target Gene是编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列(SEQ ID No:8或SEQ ID No:9)，可使细胞表达可溶性ACE2蛋白到胞外(ACE2蛋白可与冠状病毒S蛋白特异结合)，由此制得拮抗SARS-CoV感染的AAV基因药物。
不同目的基因质粒的杆状病毒可以按照如下方法制备：构建pFast-Bac-AAV-Target Gene质粒载体，将该质粒载体转染感受态DH10Bac，获得重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-Target Gene；取重组的杆状病毒质粒Bac-pFast-Bac-AAV-Target Gene转染贴壁的Sf9细胞，得到所述第三杆状病毒。
需要说明的是，作为上述方案的并列方案，也可以将编码Rep52蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP2(VP2包含VP3序列)的表达盒相连克隆到第一杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第一杆状病毒。同时将编码Rep78蛋白的表达盒与编码Cap蛋白VP1的表达盒相连克隆到第二杆状病毒载体上，分别用polyhedrin和p10启动子驱动，得到第二杆状病毒。杆状病毒的具体制备过程与上述方案类似，再此不再赘述。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中吉智药（南京） 生物技术有限公司
<120> 一种杆状病毒感染昆虫细胞生产AAV基因药物的系统及方法
<141> 2021-02-04
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3208
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
actcgacgat ggagctggtc gggtggctcg tggacaaggg gattacctcg gagaagcagt 60
ggatccagga ggaccaggcc tcatacatct ccttcaatgc ggcctccaac tcgcggtccc 120
aaatcaaggc tgccttggac aatgcgggaa agattatgag cctgactaaa accgcccccg 180
actacctggt gggccagcag cccgtggagg acatttccag caatcggatt tataaaattt 240
tggaactaaa cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt ctttctggga tgggccacga 300
aaaagttcgg caagaggaac accatctggc tgtttgggcc tgcaactacc gggaagacca 360
acatcgcgga ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg gtgcgtaaac tggaccaatg 420
agaactttcc cttcaacgac tgtgtcgaca agatggtgat ctggtgggag gaggggaaga 480
tgaccgccaa ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg aggaagcaag gtgcgcgtgg 540
accagaaatg caagtcctcg gcccagatag acccgactcc cgtgatcgtc acctccaaca 600
ccaacatgtg cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt cgaacaccag cagccgttgc 660
aagaccggat gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga tcatgacttt gggaaggtca 720
ccaagcagga agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga tcacgtggtt gaggtggagc 780
atgaattcta cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc cgcccccagt gacgcagata 840
taagtgagcc caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc atcgacgtca gacgcggaag 900
cttcgatcaa ctacgcagac aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgtg ggcatgaatc 960
tgatgctgtt tccctgcaga caatgcgaga gaatgaatca gaattcaaat atctgcttca 1020
ctcacggaca gaaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc agaatctcaa cccgtttctg 1080
tcgtcaaaaa ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca tatcatggga aaggtgccag 1140
acgcttgcac tgcctgcgat ctggtcaatg tggatttgga tgactgcatc tttgaacaat 1200
aaatgattta aatcaggtat ggctgccgat ggttatcttc cagattggct cgaggacact 1260
ctctctgaac tcgacgatgc cggggtttta cgagattgtg attaaggtcc ccagcgacct 1320
tgacgagcat ctgcccggca tttctgacag ctttgtgaac tgggtggccg agaaggaatg 1380
ggagttgccg ccagattctg acatggatct gaatctgatt gagcaggcac ccctgaccgt 1440
ggccgagaag ctgcagcgcg actttctgac ggaatggcgc cgtgtgagta aggccccgga 1500
ggcccttttc tttgtgcaat ttgagaaggg agagagctac ttccacatgc acgtgctcgt 1560
ggaaaccacc ggggtgaaat ccatggtttt gggacgtttc ctgagtcaga ttcgcgaaaa 1620
actgattcag agaatttacc gcgggatcga gccgactttg ccaaactggt tcgcggtcac 1680
aaagaccaga aatggcgccg gaggcgggaa caaggtggtg gatgagtgct acatccccaa 1740
ttacttgctc cccaaaaccc agcctgagct ccagtgggcg tggactaata tggaacagta 1800
tttaagcgcc tgtttgaatc tcacggagcg taaacggttg gtggcgcagc atctgacgca 1860
cgtgtcgcag acgcaggagc agaacaaaga gaatcagaat cccaattctg atgcgccggt 1920
gatcagatca aaaacttcag ccaggtacat ggagctggtc gggtggctcg tggacaaggg 1980
gattacctcg gagaagcagt ggatccagga ggaccaggcc tcatacatct ccttcaatgc 2040
ggcctccaac tcgcggtccc aaatcaaggc tgccttggac aatgcgggaa agattatgag 2100
cctgactaaa accgcccccg actacctggt gggccagcag cccgtggagg acatttccag 2160
caatcggatt tataaaattt tggaactaaa cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt 2220
ctttctggga tgggccacga aaaagttcgg caagaggaac accatctggc tgtttgggcc 2280
tgcaactacc gggaagacca acatcgcgga ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg 2340
gtgcgtaaac tggaccaatg agaactttcc cttcaacgac tgtgtcgaca agatggtgat 2400
ctggtgggag gaggggaaga tgaccgccaa ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg 2460
aggaagcaag gtgcgcgtgg accagaaatg caagtcctcg gcccagatag acccgactcc 2520
cgtgatcgtc acctccaaca ccaacatgtg cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt 2580
cgaacaccag cagccgttgc aagaccggat gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga 2640
tcatgacttt gggaaggtca ccaagcagga agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga 2700
tcacgtggtt gaggtggagc atgaattcta cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc 2760
cgcccccagt gacgcagata taagtgagcc caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc 2820
atcgacgtca gacgcggaag cttcgatcaa ctacgcagac aggtaccaaa acaaatgttc 2880
tcgtcacgtg ggcatgaatc tgatgctgtt tccctgcaga caatgcgaga gaatgaatca 2940
gaattcaaat atctgcttca ctcacggaca gaaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc 3000
agaatctcaa cccgtttctg tcgtcaaaaa ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca 3060
tatcatggga aaggtgccag acgcttgcac tgcctgcgat ctggtcaatg tggatttgga 3120
tgactgcatc tttgaacaat aaatgattta aatcaggtat ggctgccgat ggttatcttc 3180
cagattggct cgaggacact ctctctga 3208
<210> 2
<211> 1268
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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aaatcaaggc tgccttggac aatgcgggaa agattatgag cctgactaaa accgcccccg 180
actacctggt gggccagcag cccgtggagg acatttccag caatcggatt tataaaattt 240
tggaactaaa cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt ctttctggga tgggccacga 300
aaaagttcgg caagaggaac accatctggc tgtttgggcc tgcaactacc gggaagacca 360
acatcgcgga ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg gtgcgtaaac tggaccaatg 420
agaactttcc cttcaacgac tgtgtcgaca agatggtgat ctggtgggag gaggggaaga 480
tgaccgccaa ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg aggaagcaag gtgcgcgtgg 540
accagaaatg caagtcctcg gcccagatag acccgactcc cgtgatcgtc acctccaaca 600
ccaacatgtg cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt cgaacaccag cagccgttgc 660
aagaccggat gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga tcatgacttt gggaaggtca 720
ccaagcagga agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga tcacgtggtt gaggtggagc 780
atgaattcta cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc cgcccccagt gacgcagata 840
taagtgagcc caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc atcgacgtca gacgcggaag 900
cttcgatcaa ctacgcagac aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgtg ggcatgaatc 960
tgatgctgtt tccctgcaga caatgcgaga gaatgaatca gaattcaaat atctgcttca 1020
ctcacggaca gaaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc agaatctcaa cccgtttctg 1080
tcgtcaaaaa ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca tatcatggga aaggtgccag 1140
acgcttgcac tgcctgcgat ctggtcaatg tggatttgga tgactgcatc tttgaacaat 1200
aaatgattta aatcaggtat ggctgccgat ggttatcttc cagattggct cgaggacact 1260
ctctctga 1268
<210> 3
<211> 2211
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300
caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360
gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420
ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480
aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540
tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600
cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660
gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780
tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840
tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900
ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960
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aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980
gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040
gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100
tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160
tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211
<210> 4
<211> 1800
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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gacacagagt cagtcccaga ccctcaacca atcggagaac ctcccgcagc cccctcaggt 180
gtgggatctc ttacaatggc ttcaggtggt ggcgcaccag tggcagacaa taacgaaggt 240
gccgatggag tgggtagttc ctcgggaaat tggcattgcg attcccaatg gctgggggac 300
agagtcatca ccaccagcac ccgaacctgg gccctgccca cctacaacaa tcacctctac 360
aagcaaatct ccaacagcac atctggagga tcttcaaatg acaacgccta cttcggctac 420
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cttaccagca cggtccaggt cttcacggac tcagactatc agctcccgta cgtgctcggg 660
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gggtatctga cgcttaatga tggaagccag gccgtgggtc gttcgtcctt ttactgcctg 780
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tctggatctt taatttttgg caaacaagga actggaagag acaacgtgga tgcggacaaa 1260
gtcatgataa ccaacgaaga agaaattaaa actactaacc cggtagcaac ggagtcctat 1320
ggacaagtgg ccacaaacca ccagagtgcc caagcacagg cgcagaccgg ctgggttcaa 1380
aaccaaggaa tacttccggg tatggtttgg caggacagag atgtgtacct gcaaggaccc 1440
atttgggcca aaattcctca cacggacggc aactttcacc cttctccgct gatgggaggg 1500
tttggaatga agcacccgcc tcctcagatc ctcatcaaaa acacacctgt acctgcggat 1560
cctccaacgg ccttcaacaa ggacaagctg aactctttca tcacccagta ttctactggc 1620
caagtcagcg tggagatcga gtgggagctg cagaaggaaa acagcaagcg ctggaacccg 1680
gagatccagt acacttccaa ctattacaag tctaataatg ttgaatttgc tgttaatact 1740
gaaggtgtat atagtgaacc ccgccccatt ggcaccagat acctgactcg taatctgtaa 1800
<210> 5
<211> 4256
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt ttattgccgt catagcgcgg 60
gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc tcccccatct cccggtacct 120
tacagattac gagtcaggta tctggtgcca atggggcggg gttcactata tacaccttca 180
gtattaacag caaattcaac attattagac ttgtaatagt tggaagtgta ctggatctcc 240
gggttccagc gcttgctgtt ttccttctgc agctcccact cgatctccac gctgacttgg 300
ccagtagaat actgggtgat gaaagagttc agcttgtcct tgttgaaggc cgttggagga 360
tccgcaggta caggtgtgtt tttgatgagg atctgaggag gcgggtgctt cattccaaac 420
cctcccatca gcggagaagg gtgaaagttg ccgtccgtgt gaggaatttt ggcccaaatg 480
ggtccttgca ggtacacatc tctgtcctgc caaaccatac ccggaagtat tccttggttt 540
tgaacccagc cggtctgcgc ctgtgcttgg gcactctggt ggtttgtggc cacttgtcca 600
taggactccg ttgctaccgg gttagtagtt ttaatttctt cttcgttggt tatcatgact 660
ttgtccgcat ccacgttgtc tcttccagtt ccttgtttgc caaaaattaa agatccagac 720
aaaggaaaga aacggtcctc tccttctttg tggctggcca tagcaggtcc aggattcatc 780
aagctattac gtccattgag agcccaagaa gaagctccag gccaagcaaa ttcgctgttg 840
ttgttttgag tcacagtggt tgagacacgt tgttgtcggt agctgggtcc aggtatgtag 900
tttcttccct ggacagccat gttgctgggt ccggccacac tgaattttag cgtttgttga 960
ttctgtccag aaccgttaat agtctttgag agatagtaca agtattggtc gatgagtgga 1020
ttcattagtc ggtccaggct ttggctgtga gcgtagctgc tatggaaagg tacgttctca 1080
aactcgtagc tgaactggaa gttgttaccc gttcttagca tttgcgacgg gaaatattcc 1140
aggcagtaaa aggacgaacg acccacggcc tggcttccat cattaagcgt cagatacccg 1200
tactgaggaa tcatgaaaac gtccgctggg aacggcggga ggcagccctc gtgagccgac 1260
ccgagcacgt acgggagctg atagtctgag tccgtgaaga cctggaccgt gctggtaagg 1320
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<210> 6
<211> 4517
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
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tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980
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tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100
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agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220
taa 2223
机译： 控制在昆虫细胞中重组杆状病毒载体的昆虫细胞中生产杆状病毒杀虫剂的蛋白质杀虫剂表达的方法和Ba重组杆状病毒的表达
机译： 产生杆状病毒载体的方法，该载体能产生选择的非融合重组蛋白或能被用作转移载体;一种重组杆状病毒表达载体，其在一个条件下可以在特定的程序控制下进行表达宿主细胞;利用杆状病毒多角体蛋白启动子的重组转移载体，并将选择的基因引入杆状病毒基因组的侧翼序列，或将选择的基因插入用于基因的遗传操纵基因的方法和方法使用表达载体的宿主昆虫细胞中的非融合蛋白
机译： 在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中生产人免疫缺陷病毒蛋白的方法
