PI3K-Akt信号通路与杆状病毒感染和昆虫细胞凋亡的关系

摘要

磷脂酰肌醇—3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)—Akt信号通路在细胞增殖，细胞周期调节，有丝分裂，糖原代谢，蛋白质合成，细胞存活和凋亡等方面具有重要作用。很多病毒在感染过程中都能调控宿主细胞PI3K—Akt信号通路来完成病毒的复制。很多细胞外因子，例如严重急性呼吸综合症冠状病毒的膜蛋白，肿瘤坏死因子，放线菌素D(actinomycin D，ActD)等，诱导的哺乳动物细胞凋亡也有PI3K—Akt信号通路的参与。 但是，目前人们还不清楚鳞翅目昆虫细胞中是否存在PI3K—Akt信号通路，同时对杆状病毒在鳞翅目昆虫细胞中复制以及鳞翅目昆虫细胞凋亡时PI3K—Akt信号通路所起的作用也不了解。本文对PI3K—Akt信号通路在杆状病毒代表种——苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞过程中所起的作用进行了研究。同时也研究了PI3K—Akt信号通路在昆虫细胞凋亡过程中所扮演的角色。 首先我们考察了AcMNPV感染是否能激活Sf9细胞中的PI3K—Akt信号通路。由于Akt是PI3K下游主要效应因子，所以，Akt的磷酸化表明PI3K—Akt信号通路被活化。我们使用特异性识别磷酸化Akt的抗体进行Western blot分析发现AcMNPV感染导致Sf9细胞中磷酸化Akt水平在1 hpi(hours post—infection)开始升高，在6 hpi达到最高水平，直到18 hpi仍能检测到较高水平的磷酸化Akt。接着我们使用PI3K的特异性抑制剂LY294002来考察AcMNPV是否通过PI3K途径激活细胞Akt。分别使用0，5，10和20μM LY294002处理感染了AcMNPV的Sf9细胞，6 hpi时Western blot检测磷酸化Akt水平，结果表明Akt磷酸化水平随着LY294002浓度的升高而降低，10和20μM LY294002处理使AcMNPV感染的Sf9细胞中的磷酸化Akt降至本底水平。这些结果首次证实AcMNPV可以通过PI3K途径激活Sf9细胞Akt。 接下来我们考察了PI3K—Akt信号通路对AcMNPV在Sf9细胞中增殖的影响。病毒感染后不同时间点测定芽生型病毒(budded virus，BV)和包涵体(occlusion body，OB)数量发现，在各时间点LY294002都显著降低了BV和OB的产生。说明AcMNPV的有效增殖需要PI3K—Akt信号通路的协助。在2 hpi加入LY294002处理细胞对子代病毒产量的影响与感染前1 h加入LY294002的相似，说明LY294002并不影响病毒进入细胞。在8，12和24 hpi加入LY294002对子代病毒产量的影响逐渐降低。这些结果表明，病毒进入细胞后的早期复制过程对PI3K—Akt信号通路的依赖性较强，随后逐渐减弱。另外，Slot blot和Western blot检测发现当PI3K—Akt信号通路受到抑制后，病毒DNA合成，晚期(38K和VP39)和极晚期(多角体蛋白)基因的表达均受到抑制，但病毒极早期(IE1)和早晚期(GP64)基因的表达不受影响。上述这些结果首次证明PI3K—Akt信号通路对AcMNPV在Sf9细胞中复制具有重要作用。 由于PI3K—Akt信号通路在调控细胞存活和凋亡过程中具有重要作用，所以本研究的另一部分考察了PI3K—Akt信号通路与鳞翅目昆虫细胞凋亡的关系。结果表明LY294002可以抑制vAcP35-KO—PH—GFP(缺失抗凋亡基因p35的重组AcMNPV)诱导的Sf9细胞凋亡，Slot blot分析显示这种抑制作用是由于LY294002抑制了vAcP35-KO—PH—GFP的DNA合成。此外，LY294002也可以抑制50 ng/ml ActD诱导的Sf9和Hi5细胞凋亡。由于LY294002可以特异性地抑制PI3K的活性，所以本研究结果暗示PI3K—Akt信号通路参与了ActD诱导的Sf9和Hi5细胞凋亡。我们还研究了瞬时表达AcMNPV IE1和ActD处理对Sf9和Hi5细胞的影响。瞬时表达IE1或加入10 ng/ml ActD可以诱导Sf9细胞凋亡，而同时瞬时表达IE1并用10 ng/ml ActD处理的Sf9细胞存活率明显低于只使用其中一种处理时的细胞存活率。只瞬时表达IE1或只用10 ng/ml ActD处理都不能诱导Hi5细胞凋亡，但同时处理可以诱导Hi5细胞凋亡，暗示ActD增加了Sf9和Hi5细胞对AcMNPV IE1的敏感性，或者AcMNPV IE1增加了Sf9和Hi5细胞对ActD的敏感性。

目录

文摘

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论文说明:缩略词

声明

前 言

第一章文献综述

1.1杆状病毒简介

1.1.1杆状病毒的基本特征

1.1.2杆状病毒的分类

1.2 PI3K-Akt信号通路研究概况

1.2.1 PI3K的结构和活化机制

1.2.2 Akt的结构和活化过程

1.2.3 PI3K-Akt信号通路的主要功能

1.3 PI3K-AKT信号通路与病毒感染

1.3.1病毒对细胞PI3K-Akt信号通路的调节

1.3.2病毒调节细胞PI3K-Akt信号通路对细胞的影响

1.3.3杆状病毒与细胞信号通路

1.4细胞凋亡

1.4.1细胞凋亡的概念

1.4.2细胞凋亡的信号转导过程

1.4.3细胞凋亡的生物学意义

1.4.4杆状病毒诱导的细胞凋亡

第二章材料与方法

2.1实验材料和仪器

2.1.1细胞和病毒

2.1.2质粒和菌株

2.1.3主要试剂

2.1.4主要溶液及其配制

2.1.5仪器

2.2方法

2.2.1 病毒的虫体感染增殖

2.2.2虫体内多角体的分离纯化

2.2.3病虫血淋巴制备

2.2.4昆虫细胞的离体培养

2.2.5病毒滴度测定

2.2.6细胞内病毒多角体的计数

2.2.7蛋白印迹(Westem blot)

2.2.8细胞胞内总DNA的提取

2.2.9 Slot blot分析

2.2.10瞬时表达载体构建

2.2.11 DNA转染

2.2.12活细胞计数

第三章PI3K-Akt信号通路在AcMNPV感染Sf9细胞过程中的作用

3.1前言

3.2结果

3.2.1 LY294002对Sf9细胞的影响

3.2.2 AcMNPV通过PI3K途径激活Sf9细胞Akt

3.2.3抑制PI3K-Akt信号通路降低子代病毒的产量

3.2.4不同时间点加入LY294002对子代病毒产量的影响

3.2.5不同浓度LY294002对子代病毒产量的影响

3.2.6抑制PI3K-Akt信号通路导致病毒DNA的合成降低

3.2.7抑制PI3K-Akt信号通路导致病毒晚期和极晚期基因的表达受到抑制

3.3讨论

3.4小结

第四章PI3K-Akt信号通路与Sf9细胞凋亡的关系

4.1前言

4.2结果

4.2.1 LY294002抑制vAcP35-KOH-GFP诱导的Sf9细胞凋亡

4.2.2 LY294002抑制vAcP35-KO-PH-GFP DNA合成

4.2.3杆状病毒DNA复制与细胞凋亡的关系

4.2.4 LY294002抑制ActD诱导的昆虫细胞凋亡

4.2.5IE1和GFP表达质粒的构建和鉴定

4.2.7 IE1瞬时表达诱导Sf9细胞凋亡

4.2.8ActD和IE1共同作用增强了细胞凋亡

4.3讨论

4.4小结

总 结

展 望

参考文献

在读博期间发表的论文

致谢