大鼠血管球囊损伤后血管平滑肌细胞的增殖和凋亡与雷帕霉素的干预

摘要

背景:介入治疗是目前国内外广泛开展的冠心病非外科治疗的重要方法。其中经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)有效、简便、安全,是目前应用最多的介入治疗方法之一。近年来,在近百个国家和地区采用该方法治疗冠心病的病例已超过了同期外科搭桥病例数。然而,PTCA后冠状动脉再狭窄(Restenosis, RS)的比例较高,严重影响了PTCA的远期疗效。引起广大临床和基础科研工作者的极大关注,并进行了大量研究。实验室资料显示球囊扩张后再狭窄与血管弹性回缩、血栓的形成和机化,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增生及细胞外基质的聚集等有关。其中血管平滑肌细胞的过度增殖可能是再狭窄形成的主要原因。对血管进行球囊扩张后,血管内皮和中膜平滑肌细胞受到牵拉、损伤,在修复过程中在一系列生长因子的刺激作用下,VSMC过度增殖、并向内膜方向迁移。因而抑制VSMC过度增殖以防治再狭窄成为广大医务工作者关注和研究的课题。实验研究显示 P27蛋白和雷帕霉素等有较强的抑制细胞增殖的作用。
　　P27蛋白[1]是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependnt kinase inhibitor, CKI),通过抑制周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependnt kinase,CDK)来调节细胞周期。P27基因的蛋白表达形式有[2]:P27kip1,P27Ick,P27Pic2等,其中 P27kip1是最常见的蛋白表达形式。P27蛋白的高表达可显著抑制血管平滑肌细胞增殖,有望成为治疗PTCA后再狭窄的新手段。
　　雷帕霉素(Rapamycin)是一种已应用于器官移植后抗排斥反应的新型免疫抑制剂,可通过不同途径调节细胞周期而抑制细胞增殖。资料显示雷帕霉素有抑制 P27蛋白降解的作用,但在对VSMC的增殖与凋亡之间的关系尚无一致意见。
　　细胞凋亡是指细胞在一定的生理和病理条件下,遵循自身程序而结束自己生命的过程。动脉球囊扩张后再狭窄过程中,可见有平滑肌细胞的凋亡,但凋亡出现的时间和凋亡的程度目前尚无一致意见。
　　目的:本研究拟通过经皮球囊血管内成形术( percutaneous transluminal angioplasty, PTA)建立大鼠腹主动脉球囊损伤模型,研究 P27蛋白水平与血管平滑肌细胞增殖程度的关系及国产雷帕霉素的干预作用。
　　方法:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠150只,分笼饲养于标准实验房(22℃),给予规律光照(12h:12h),自由饮食,随机分假手术组(n=20)、单纯球囊损伤组( n=40)、羧甲基纤维素组(n=40)和雷帕霉素给药组(n=40)4组。假手术组单纯分离并结扎颈总动脉;单纯球囊组、羧甲基纤维素对照组和雷帕霉素组球囊过度扩张损伤腹主动脉;羧甲基纤维素组术后注射羧甲基纤维素钠液稀0.25mg/kg,雷帕霉素组术后注射雷帕霉素0.25mg/kg。术中术后动物死亡10只。各组于术后3天、7天、14天、21天及28天处死动物,取腹主动脉检测观察:1、常规制片,HE染色观察组织学结构。2、免疫组化法测定α-肌球蛋白和PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)检测大鼠血管平滑肌细胞增殖情况。3、Western-blot法、流式细胞计数(flow cytometry, FCM)检测大鼠血管平滑肌细胞增殖、凋亡情况及 P27蛋白表达情况。
　　结果:1大鼠血管经球囊损伤后内皮细胞剥脱,内弹力板破坏、断裂,7天时平滑肌细胞明显增殖,14天时增殖达到高峰并向内皮细胞层迁移、增殖,术后28天细胞仍有增殖;雷帕霉素组新生内膜面积比对照组减少36.4％(0.14±0.03mm2 vs0.23±0.06mm2 at14 days,P<0.01),内膜/中膜之比少28.9%(17.7±3.37%vs28.86±10.25%at14 days, P<0.01)。
　　2、1)细胞周期:14天时对照组G0-G1期细胞数占总细胞数68.35±6.32%,雷帕霉素给药组G0-G1期细胞数占总细胞数82.55±7.51%,雷帕霉素组VSMC G0-G1期细胞数明显多于对照组(P<0.01)。2)CDK2和cyclinE:术后不同时间段各雷帕霉素给药组CDK2,cyclinE表达均下降,14天时表达明显低于对照组33.76±2.85 vs22.83±2.10,和28.32±1.35 vs18.32±2.10(P<0.01)。3)术后3天、7天、14天、21天和28天雷帕霉素组P27Kip1表达均高于对照组(P<0.01),其中14天时 P27Kip1最高67.4±2.8 vs33.6±2.7。4)对照组和雷帕霉素组术后3天细胞凋亡率分别为9.1±1.1% vs14.2±2.1%,雷帕霉素组比对照组增高24.5±2.6%(P<0.01);至7天时逐渐下降,14天、21天、28天时凋亡数降低。
　　3、雷帕霉素组血胆固醇升高1.28±0.42(术前) vs1.77±0.47(术后28天),肾功能、外周血白细胞计数无改变。
　　结论:
　　1、球囊过度扩张可损伤动脉血管,损伤后动脉血管平滑肌细胞开始增殖;损伤后早期可见血管平滑肌细胞凋亡,其后有较低水平的细胞凋亡。
　　2、损伤后血管平滑肌细胞 P27蛋白的表达随时间的推移变化,损伤后表达开始增加,14天时表达最高,以后缓慢下降。P27蛋白在增殖的血管平滑肌细胞中表达水平升高与VSMC增殖的抑制有关。
　　3、雷帕霉素可使 P27蛋白保持较高水平,同时降低CDK2、cyclinE的表达水平。P27蛋白高表达时未见有细胞凋亡的增加。雷帕霉素可能增加早期血管平滑肌细胞的凋亡率而减少细胞增殖程度。

目录

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材 料 与 方 法

一、材料

（一）实验动物

（二）主要实验仪器

（三）主要试剂

二、研究方法

（一）动物实验部分

（一）球囊损伤腹主动脉进行组织学观察与图像分析

（二）血管平滑肌细胞增殖检测

（三）Western－blot[14]法 P27蛋白定性分析：

（四）流式细胞计数定量蛋白表达及检测细胞凋亡：

（五）其他指标的监测

结果

一、 球囊损伤后腹主动脉血管平滑肌细胞的增殖

二、 雷帕霉素对球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖的影响

三、 血管平滑肌细胞凋亡的检测：

讨论

一、血管平滑肌细胞的增殖和凋亡对再狭窄的影响

三、P 27kip1在细胞周期调控中的作用

四、雷帕霉素的作用机制及其在细胞增殖与凋亡中的调控

五、关于雷帕霉素的应用

结论

参 考 文 献

综述

参考文献

致谢