脑震荡对大鼠学习记忆的影响及其神经机制的实验研究

摘要

背景与目的:脑震荡(concussive brain injury, CBI)属于轻型脑外伤(mild traumatic brain injury),是最常见的脑损伤形式之一,多见于交通事故和各种暴力案件。脑震荡的临床特征是脑外伤后出现短暂的意识丧失不伴有明显的脑内结构损害,常可遗留包括学习记忆功能障碍在内的一系列症状,这些症群可长期存在,被称为脑震荡后综合征(post-concussion syndrome,PCS)。在人类脑震荡中学习记忆障碍是 PCS中最持久和对人们健康生活影响最严重的问题之一,然而这并未引起人们的足够重视,这方面的研究也缺乏系统性。相当一部分脑震荡病例的发生都要涉及到法律诉讼问题,而基于上述原因,对脑震荡引起的学习记忆障碍的法医学鉴定尚缺乏科学依据;对脑震荡的临床治疗也还有待于进一步的提高认识。所以,建立脑震荡的动物模型,系统研究脑震荡对学习记忆的影响及其神经机制,对脑震荡的法医学鉴定、脑震荡的临床治疗等诸多方面都具有重要意义。
　　材料和方法:84只大鼠随机分成10组,A、C、E、G、I、J组为脑震荡打击组,每组10只;B、D、F、H组为非打击组,每组6只。为观察脑震荡对大鼠的学习记忆的影响,A组于打击前行水迷宫训练,打击后检测其记忆保持情况,B为对照组;C组打击后检测其空间学习能力、参照记忆和工作记忆能力,D组为对照组。
　　为探讨脑震荡对大鼠空间学习记忆能力影响的神经机制,E组于打击后72小时处死,取脑组织检测海马 CA3区锥体细胞凋亡情况,F组为对照组。G组、I组和 J组分别于打击后给予生理盐水、纳洛酮和多巴胺 D2受体拮抗剂舒必利腹腔注射,H组给予生理盐水腹腔注射作为对照组,7天后用水迷宫技术检测上述四组动物的空间学习记忆能力。打击后14天动物被处死后取脑组织,一侧脑组织用于激光共聚焦显微镜检测海马 CA3区锥体细胞内 Ca2+积聚情况,另一侧脑组织制成组织蜡块后,切片进行海马 CA3锥体细胞计数。
　　结果：
　　1)打击后24小时 A组动物探索试验穿越原平台位置水域次数明显比 B组动物少(P<0.05),打击后48、72小时两组动物探索试验无差异(P>0.05)。提示动物脑震荡后出现了一过性逆行性遗忘,48小时后恢复。
　　2)打击后第8至13天 C组动物隐匿平台逃避潜伏期明显比 D组动物长(P<0.05),第13天进行的探索试验 C组动物穿越原平台位置水域的次数明显比D组动物少(P<0.05),可见平台试验无差异(P>0.05),提示脑震荡对动物参照记忆的获得和保持均有影响,并排除了脑震荡后动物感觉和运动功能改变的影响。第15至18天的工作记忆检测,C组动物每天的第一次尝试和第二次尝试逃避潜伏期的差异无统计学意义(P>0.05),D组动物每天的第一次尝试和第二次尝试逃避潜伏期的差异有统计学意义(P<0.05)。提示脑震荡损害了动物的工作记忆
　　3)G组(脑震荡+生理盐水组)、H组(假打击+生理盐水组)、I组(脑震荡+纳洛酮组)和 J组(脑震荡+舒必利组)各组动物水迷宫行为学检测结果:从打击后第8至13天,每天比较,G组动物的隐匿平台逃避潜伏期明显比 H、I、J组动物长(P<0.01),H、I、J组之间无统计学差异(P>0.05)。第14天探索实验结果:H、I、J组动物的穿越次数明显比 G组多(P<0.01)。H、I、J组之间无统计学差异(P>0.05)。以上结果说明,脑震荡损害了大鼠的学习记忆能力;纳洛酮以及舒必利均能明显改善脑震荡后大鼠的空间学习记忆能力。
　　4)E组(脑震荡组)海马 CA3区锥体细胞层见大量 TUNEL阳性细胞,F组(假打击组)海马 CA3区锥体细胞层偶见 TUNEL阳性细胞,病理图像分析结果显示,E组的海马 CA3区凋亡细胞数、凋亡细胞平均光密度、凋亡细胞面密度以及数密度均明显高于 F组(P<0.01)。E组凋亡细胞平均灰度值明显低于 F组(P<0.01)。E组动物海马 CA3区锥体细胞的超微结构发生以下变化:线粒体肿胀,嵴减少,空泡样变性;核膜皱缩,染色质边集。F组动物未见上述改变。E组动物海马 CA3区锥体细胞的超微结构改变符合凋亡特征。说明脑震荡能引起大鼠海马 CA3区锥体细胞凋亡,凋亡是脑震荡大鼠海马 CA3区锥体细胞选择性丢失的主要机制之一。
　　5)G组动物海马 CA3区锥体细胞内游离钙荧光探针 fluo-3/AM的荧光量组明显高于 H、I、J组(P<0.01),说明脑震荡导致大鼠海马 CA3区锥体细胞内游离钙积聚,提示脑震荡后大鼠海马内谷氨酸释放增多,发生了 Ca2+-兴奋偶联,纳洛酮和舒必利两种药物均能减少脑震荡动物海马CA3区锥体细胞内Ca2+积聚。H、I、J组之间无明显差异(P>0.05)。
　　6)G、I、J组动物海马 CA3区锥体细胞数平均值明显比 H组低(P<0.01),说明脑震荡导致了大鼠海马 CA3区锥体细胞的丢失;I、J组动物海马 CA3区锥体细胞计数平均值明显比 G组高(P<0.01),说明脑震荡后纳洛酮和舒必利两种药物均对动物海马 CA3区锥体细胞有保护作用。I组动物海马 CA3区锥体细胞计数平均值明显比 J组高(P<0.01),说明纳洛酮对脑震荡后大鼠海马 CA3区锥体细胞的保护作用效果比舒必利好。
　　结论:
　　1)脑震荡打击后,大鼠出现了类似人类脑震荡的一过性逆行性遗忘和长达18天的空间学习记忆功能障碍。
　　2)大鼠脑震荡后学习记忆缺失与海马 CA3区锥体细胞减少有关。
　　3)脑震荡大鼠海马 CA3区锥体细胞凋亡试验呈阳性,提示凋亡是大鼠脑震荡后海马 CA3区锥体细胞减少的主要途径之一。
　　4)脑震荡大鼠海马 CA3区锥体细胞内 Ca2+积聚明显,提示脑震荡后海马内兴奋毒性氨基酸释放增多并参与了海马 CA3区锥体细胞的损害机制。
　　5)纳洛酮和舒必利均能明显减轻脑震荡大鼠的空间学习记忆缺失,减轻脑震荡后 CA3区锥体细胞内 Ca2+积聚,纳洛酮和舒必利治疗组动物海马 CA3区锥体细胞计数明显比对照组多,提示脑震荡后脑内内源性阿片肽和多巴胺的增多引起海马 CA3区锥体细胞损害,导致学习记忆能力受损。这一研究结果为脑震荡后学习记忆缺失的临床治疗提供了新的途径,也对脑震荡对学习记忆损害的神经机制做了重要补充。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

一、临床学及病理学观察

二、Morris 水迷宫行为学检测

二、TUNEL试验

三、透射电镜观察

四、海马CA3区锥体细胞内Ca2+积聚

五、海马CA3区锥体细胞计数

讨论

一、脑震荡对学习记忆的影响

二、脑震荡对大鼠学习记忆损害的神经机制

三、本研究结果对脑震荡的法医学鉴定的意义

结论

参考文献

文 献 综 述

参 考 文 献

致谢